酯酶的克隆、表達、篩選以及立體選擇性的定向進化研究.pdf

1、酯酶(EC3.1.1.x)是能夠催化一系列酯鍵生成相應的酸和醇的重要生物催化劑。其在有機溶劑中有較好的穩(wěn)定性、活性及立體選擇性，因此被廣泛用于合成食品添加劑、農(nóng)用化學品和醫(yī)藥中間體等重要化合物.在本課題中，我們采用分子克隆手段，從大腸桿菌K-12中克隆表達出一系列的酯酶并且研究其性質。另外我們通過定向進化對該類酶進行改造，獲得了立體選擇性得到明顯提高的酯酶。
　　 通過GenBank數(shù)據(jù)庫分析，從大腸桿菌K-12中篩選了酯酶基因

2、，經(jīng)PCR擴增后，獲得了31個不同的酯酶基因片段，用內切酶雙酶切后，與經(jīng)過相同的限制性內切酶切割的載體pET-30a(+)連接，轉化到大腸桿菌BL21中。重組菌在IPTG的誘導下表達，經(jīng)過SDS-PAGE分析后，獲得了相應的目標蛋白。
　　 建立了一種結合酯酶活性與立體選擇性的高效篩選策略。以4-硝基苯丁酸酯為活性篩選的底物，通過檢測405nm下的吸光度，獲得了5個活性較好的酯酶(XL3，XL10，XL15，XL27，XL31)

3、。再以1-乙酸苯乙酯作為底物進行立體選擇性篩選，以1mmol/L溴百里香芬蘭作為指示劑，利用酶標儀在630nm下檢測各個酶催化水解反應中吸光度的變化，獲得了對1-乙酸苯乙酯具有較高立體選擇性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反應和酯化反應對XL15進行復篩，轉化率分別達到31.2％和36.8%，其對映體選擇性(E值)均大于100。
　　 在對克隆獲得酯酶的酶學性質的研究中發(fā)現(xiàn)，對于短鏈4-硝基苯酯，上述5個酯酶均具有較高的

4、活性，但對于長鏈4-硝基苯酯，酶的活性明顯下降。不同的酶的最佳反應pH值和反應溫度亦不同。
　　 通過對酯酶XL15進行誘導表達條件的優(yōu)化，獲得了最佳蛋白表達條件：IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導前菌體生長量為OD600=0.7，誘導溫度為30℃。進一步對酯酶XL15進行蛋白純化，獲得了大小為28kDa的目標條帶。通過序列分析與比對，XL15屬于α/β/α水解酶結構，具有典型的Ser-His-Asp活性位點。初步預測表明，

5、其活性中心附近存在一個類似“口袋”的結構，對于R-乙酸苯乙酯，手性碳上苯環(huán)的指向使得甲基能夠比較好地契合到小口袋中，從而使該酶具有對R-乙酸苯乙酯較好的立體選擇性。
　　 為了提高酯酶的立體選擇性，我們采用了定向進化手段.所研究的酶為來自紅球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP_2728酯酶。整個過程中，我們建立了有效的定向進化策略和高通量篩選方法。利用易錯PCR技術，進行了四輪突變，獲得了突變株A6A5，B

6、7F11，C8G1和D3E11，在對扁桃酸甲酯的水解反應中，其立體選擇性相比較于野生菌株，對映體選擇率（E值）從3.1分別提高到5.3，8.8，14.0和30.8;活性相對于野生菌株，從10U/mg分別提高到43U/mg，142U/mg，88U/mg和24U/mg。序列分析表明，突變體A6A5的62位上的氨基酸發(fā)生了突變，由原先的天冬酰胺變成了酪氨酸；突變體B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榱死野彼幔?45位上的亮氨酸變成了組氨