2-氯丙酸脫鹵酶的定向進(jìn)化.pdf

1、2-氯丙酸是一種重要的化工中間體，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥等行業(yè)。使用2-氯丙酸脫鹵酶制備光學(xué)純2-氯丙酸的有重要的意義。
　　 本文首先通過(guò)易錯(cuò)PCR手段將S-2-氯丙酸脫鹵酶定向進(jìn)化，并篩選得到進(jìn)化酶Deh(Ⅱ)-B2，該酶的最適pH為9.5，最適溫度為60℃，Vmax和Km的值分別為2.63×10-3 mM·min-1和0.75 mM。進(jìn)化酶的比活比原始酶提高了3.9倍。通過(guò)分子模擬和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，Deh(Ⅱ)-B2的

2、活化能下降了1.4 kcal/mol，催化殘基Asp10與底物α碳原子的距離縮短了0.3216 nm。在兩者的綜合作用下使酶活力提高。
　　 其次，通過(guò)定點(diǎn)突變改造R-2-氯丙酸脫鹵酶的Asn203位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)镾er203時(shí)，酶的選擇性由催化R-2-氯丙酸轉(zhuǎn)化為催化S-2-氯丙酸，比活降到0.101U/mg;當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)镚ln203時(shí)，酶的選擇性未變，但是比活降低了17％。突變?yōu)槠渌被峋Щ?。同源建模結(jié)果表明空

3、間位阻效應(yīng)和氫鍵作用可以很好的解釋各種突變體的比活變化。
　　 最后，通過(guò)易錯(cuò)PCR手段將R-2-氯丙酸脫鹵酶定向進(jìn)化，并篩選得到有效突變子庫(kù)，突變子DehD(Ⅳ)-G2和DehD(Ⅳ)-E7的酶活力分別提高24.8％和39.6％。通過(guò)SYBYL對(duì)酶與底物進(jìn)行分子對(duì)接顯示，DehD(Ⅳ)-G2的活化能下降0.23kcal/mol，DehD(Ⅳ)-E7的活化能下降0.61 kcal/mol。由于酶和底物R-2-氯丙酸的活化能下降，