基于定向進(jìn)化方法改進(jìn)鹵醇脫鹵酶HheC的熱穩(wěn)定性.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制來催化鄰鹵醇和環(huán)氧化物之間的相互轉(zhuǎn)化，而且它的催化反應(yīng)是非常高效高選擇性的。正因?yàn)榫哂羞@些特點(diǎn)，使得鹵醇脫鹵酶可以廣泛應(yīng)用在手性藥物及精細(xì)化工合成領(lǐng)域中，用來合成具有光學(xué)純的高價(jià)值化學(xué)中間體。然而，由于工業(yè)生產(chǎn)條件的苛刻，鹵醇脫鹵酶對極端條件尤其是高溫不具有耐受性，使其在工業(yè)生產(chǎn)中不能夠很好的發(fā)揮其催化性能。為此，我們采用蛋白質(zhì)工程手段來提高鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性。由于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性往往受多種因素影響

2、，很難采用理性設(shè)計(jì)的方法來實(shí)現(xiàn)，因此本文采用定向進(jìn)化方法對鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造研究。
　　本研究中，結(jié)合已有鹵醇脫鹵酶的酶活力篩選方法的篩選效率，我們首先采用大引物易錯(cuò)PCR的方法構(gòu)建了一個(gè)低突變頻率（2-3 a.a. mutation/gene）文庫。在篩選了2000多個(gè)克隆后，我們最終得到了6個(gè)突變體包含8個(gè)突變位點(diǎn)，且這些突變體在55℃下處理100 min后的殘余活性比野生型提高15倍左右。為了進(jìn)一步提高突變體的熱穩(wěn)

3、定性，我們采用迭代定點(diǎn)飽和突變（ISM）策略對得到的位點(diǎn)進(jìn)行疊加。通過篩選2200個(gè)突變體后，我們得到了一系列熱穩(wěn)定性更高的突變體，其中最好的突變體Var4在65℃條件下t1/2比野生型提高3400倍，并且在75℃下放置30 min后仍然保留75％的殘余活性。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)和動力學(xué)拆分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)最好的突變體Var3和Var4并沒有因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)的引入而影響了其活性，而且對二氯一苯基乙醇的對映體選擇性并未有較大的影響。相關(guān)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表