創(chuàng)建快速進(jìn)化策略研究鹵醇脫鹵酶碳末端功能.pdf

1、鹵醇脫鹵酶，是一類存在于微生物降解有機(jī)鹵化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，它不僅可以通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制，催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化生成環(huán)氧化物和鹵化氫，還能在一系列親核試劑N3-、CN-和NO2-等介導(dǎo)下，高效高選擇地催化其逆反應(yīng)-環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)反應(yīng)，可以用來(lái)合成光學(xué)純的環(huán)氧化物以及β-取代醇等一系列高價(jià)值手性藥物中間體。因此，該酶具有十分重要的工業(yè)應(yīng)用前景。
　　通過(guò)對(duì)目前研究較為廣泛的三類鹵醇脫鹵酶進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)

2、源于放射形土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium radiobacter AD1）中的鹵醇脫鹵酶（HheC），在其碳末端與另兩類鹵醇脫鹵酶存在著顯著的序列特征差異，即前者擁有長(zhǎng)于另兩類酶約10個(gè)氨基酸的碳末端區(qū)域。相關(guān)研究表明，這段看似冗長(zhǎng)的碳末端區(qū)域，對(duì)鹵醇脫鹵酶行使催化功能具有十分重要的作用，但對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制還缺乏深入地研究。為了更高效地研究碳末端的具體功能，本論文在迭代式飽和突變策略（Iterative Saturation

3、Mutagenesis，ISM）的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了兩種多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略。通過(guò)運(yùn)用相關(guān)策略，系統(tǒng)地研究和揭示了鹵醇脫鹵酶碳末端的具體功能以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　（1）使用定點(diǎn)缺失突變技術(shù)，逐一研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個(gè)氨基酸位點(diǎn)在酶催化反應(yīng)過(guò)程中的作用。對(duì)所獲得的10個(gè)碳末端氨基酸缺失突變體Δ1~Δ10，進(jìn)行了表達(dá)純化和功能檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)：碳末端氨基酸的缺失，對(duì)鹵醇脫鹵酶的催化活性有相當(dāng)顯著的負(fù)效應(yīng)，其中缺失突

4、變體Δ7~Δ10幾乎完全喪失了催化活性。此外，碳末端氨基酸缺失后，還對(duì)酶的熱穩(wěn)定性具有十分顯著的負(fù)效應(yīng)。這些結(jié)果表明，該碳末端區(qū)域?qū)u醇脫鹵酶行使催化功能是必不可少的。
　?。?）使用單點(diǎn)飽和突變技術(shù)，系統(tǒng)地研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個(gè)氨基酸位點(diǎn)在酶催化反應(yīng)過(guò)程中的具體功能及調(diào)控機(jī)制。通過(guò)基于酶催化活性和熱穩(wěn)定性的文庫(kù)篩選，獲得了20個(gè)單點(diǎn)優(yōu)勢(shì)突變體，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)純化和功能檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)：碳末端關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)249和252~25

5、4發(fā)生突變后，對(duì)鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性分別具有十分明顯地增強(qiáng)作用，證實(shí)了碳末端區(qū)域?qū)Υ呋钚院蜔岱€(wěn)定性均具有一定的調(diào)控功能。其中，碳末端關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)253和254，被證實(shí)能夠在不影響鹵醇脫鹵酶催化活性情形下，獨(dú)立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性。同源建模分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)突變體P253D和P253N，在氨基酸位點(diǎn)253和254之間增加了兩個(gè)氫鍵，能夠較好地穩(wěn)定整個(gè)碳末端區(qū)域的構(gòu)象，使得它們的熱穩(wěn)定性明顯改善。相關(guān)結(jié)果表明：碳末端區(qū)域內(nèi)氨基酸之間

6、的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其維持和調(diào)控鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性有著不可替代的作用。
　?。?）創(chuàng)建高效的多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略，用于后續(xù)進(jìn)一步研究和調(diào)控鹵醇脫鹵酶碳末端功能。首先，在ISM策略的基礎(chǔ)上，結(jié)合簡(jiǎn)并密碼子設(shè)計(jì)工具DC-Analyzer，創(chuàng)建了非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略，并成功用于增強(qiáng)鹵醇脫鹵酶的催化活性實(shí)例中。在對(duì)5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改造研究中，通過(guò)篩選約900個(gè)單克隆，獲得了催化活性較野生型提高9.3倍的高效突變體。但是，該策略用于含有多個(gè)連

7、續(xù)或者相鄰位點(diǎn)的改造研究時(shí)，基于DC-Analyzer所設(shè)計(jì)的引物數(shù)目會(huì)大大增加。隨后，針對(duì)DC-Analyzer的應(yīng)用局限，成功地開(kāi)發(fā)了適用于連讀多位點(diǎn)突變重組的簡(jiǎn)并密碼子工具M(jìn)DC-Analyzer。在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略，并成功運(yùn)用于提高鹵醇脫鹵酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性實(shí)例中。在對(duì)6個(gè)和7個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改造研究中，通過(guò)篩選1,151和384個(gè)單克隆，分別獲得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍熱失活半衰期的高效

8、突變體。這些結(jié)果表明，本論文所創(chuàng)建的快速進(jìn)化策略，能夠高效便捷地用于快速提高生物催化劑的催化特性。
　?。?）運(yùn)用所創(chuàng)建的快速進(jìn)化策略，研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)245，249，252，253和254的重組效應(yīng)，進(jìn)一步地調(diào)控和改善酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性。首先，使用非連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略，研究碳末端區(qū)域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)245、249和252的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)酶的催化活性和熱穩(wěn)定性都有相當(dāng)明顯的加和

9、效應(yīng)，并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶5.0倍催化活性以及3.1倍熱失活半衰期的高效突變體DL10。隨后，運(yùn)用連續(xù)多位點(diǎn)快速進(jìn)化策略，在DL10的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)253和254的重組效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變后，能夠在不影響DL10催化活性的前提下，獨(dú)立地調(diào)控酶的熱穩(wěn)定性，并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶4.0倍催化活性以及17.8倍熱失活半衰期的高效突變體PX14?？梢?jiàn)，碳末端氨基酸調(diào)控鹵醇脫鹵酶的催