鹵醇脫鹵酶的表達(dá)、改造及其在(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯合成中的應(yīng)用.pdf

1、鹵醇脫鹵酶能夠催化鄰鹵代醇化合物脫鹵形成環(huán)氧化物，并釋放鹵素離子和質(zhì)子；另外，鹵醇脫鹵酶也可以催化親核試劑開(kāi)環(huán)環(huán)氧化合物形成β-取代醇。鹵醇脫鹵酶介導(dǎo)的催化反應(yīng)具有高效性、高立體選擇性和高區(qū)域選擇性，使其在手性鹵代醇、環(huán)氧化物、β-取代醇等化合物的合成中占有重要地位。(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(HN)作為一種重要的β-羥基腈化合物，是合成阿托伐他汀鈣等降血脂藥物的重要中間體。由于鹵醇脫鹵酶催化合成HN的過(guò)程具有反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)

2、步驟簡(jiǎn)短，產(chǎn)物收率高等優(yōu)點(diǎn)，該工藝過(guò)程已得到越來(lái)越多的科研工作者的重視。本論文圍繞鹵醇脫鹵酶合成HN的過(guò)程展開(kāi)研究，主要包括以下研究工作：
　　論文首先利用基因挖掘的方法從短鏈脫氫/還原酶的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了六條與鹵醇脫鹵酶氨基酸序列同源性較高的酶基因，通過(guò)克隆表達(dá)和活力分析證明來(lái)自嗜清潔細(xì)小桿菌（Parvibaculum lavamentivorans DS-1）的SDR6基因在E.coli BL21(DE3)/pET-32a(

3、+)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)物顯示出鹵醇脫鹵酶活力。氨基酸序列同源性比對(duì)分析顯示SDR6與已報(bào)道的3類(lèi)鹵醇脫鹵酶的同源性均在30％左右，為一類(lèi)新型的鹵醇脫鹵酶，并命名為HheD。后續(xù)對(duì)HheD進(jìn)行了表達(dá)純化和酶學(xué)性質(zhì)的表征，包括底物譜分析、金屬離子對(duì)酶活力的影響、動(dòng)力學(xué)拆分環(huán)氧化物等。此外，利用全基因合成的方法克隆表達(dá)了已報(bào)道的鹵醇脫鹵酶HheAAD2、HheBGP1和HheC，與HheD共同建立鹵醇脫鹵酶酶庫(kù)。
　　研究了鹵醇脫鹵酶催化1

4、,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)合成(S)-4-氯-3-羥基丁腈[(S)-CHBN]的過(guò)程。經(jīng)過(guò)酶的篩選，發(fā)現(xiàn)HheC在催化1,3-DCP合成(S)-CHBN的過(guò)程中顯示出較好的活力和立體選擇性。通過(guò)催化條件的優(yōu)化和定點(diǎn)突變研究，實(shí)現(xiàn)了HheC突變體 W249F催化10g/L1,3-DCP轉(zhuǎn)化合成(S)-CHBN，收率為86%，ee值為97.5%；通過(guò)HheC突變體W249F和W249F/W139D的協(xié)同催化，實(shí)現(xiàn)了20g/L1,

5、3-DCP轉(zhuǎn)化合成(S)-CHBN，收率為86%，ee值為96.9%。
　　研究了鹵醇脫鹵酶催化(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]合成HN的過(guò)程。經(jīng)過(guò)酶的篩選，發(fā)現(xiàn)HheD在催化(S)-CHBE合成HN的過(guò)程中顯示最佳的催化效率。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的溫度和pH的優(yōu)化，確定其最佳的反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為8.0。在此條件下，使用40g DCW/L的HheD全細(xì)胞催化200g/L(S)-CHBE轉(zhuǎn)化合成HN，反應(yīng)14

6、h，(S)-CHBE轉(zhuǎn)化率為95%，HN的收率為85%。
　　基于疊氮離子的比色分析，建立鹵醇脫鹵酶活力測(cè)定的高通量方法，并用于HheD的定向進(jìn)化過(guò)程。通過(guò)error-prone PCR建立隨機(jī)突變文庫(kù)，從2500個(gè)突變體中篩選獲得優(yōu)良突變體F176M、A187R和A187S，其活力相對(duì)于野生型 HheD(HheD-WT）分別提高2.1、1.8和1.6倍。將突變位點(diǎn)進(jìn)行組合后，得到突變體F176M/A187R和F176M/A187