雙重組菌耦合不對稱還原生產(chǎn)（R）-或（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的研究.pdf

1、手性化合物由于其特殊的生物活性，已經(jīng)在醫(yī)藥、農(nóng)藥、材料、香精香料及昆蟲信息素和激素等方面得到廣泛的應用。近年來，用手性技術不對稱催化合成手性化合物及其手性中間體已經(jīng)引起了學術界和企業(yè)界的重視，成為研究開發(fā)的熱點。利用微生物酶不對稱催化具有反應條件溫和、轉化率高及立體選擇性好等優(yōu)點，已經(jīng)成了諸多手性合成方法的首選。本文將以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作為β-羰基酯還原的模型底物，利用基因工程技術構建的重組大腸桿菌分別表達單一醛基還原酶和

2、羰基還原酶，研究用這兩個重組菌分別催化COBE不對稱還原為相應R-或S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(CHBE)的反應規(guī)律。為了解決輔酶再生的問題，構建了表達葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌作為還原型輔酶NADPH的再生系統(tǒng)，研究了分別與上述兩個重組菌耦合催化4-氯乙酰乙酸乙酯還原反應的特性。 研究工作的主要進展包括：一、從赭色擲孢酵母(SporobolomycessalmonicolorZJU010)細胞中克隆得到了醛基還原酶(NADP

3、H-dependentaldehydereductase，ALR)基因，構建了含ALR基因的表達質粒并轉化到大腸桿菌中。通過篩選，獲得高效表達醛基還原酶的重組菌EcoliM15(pQE30-ALR)，經(jīng)培養(yǎng)和誘導條件優(yōu)化，該重組菌的比酶活提高到7.28U/mg，比酶活比原始菌株高14倍。在水相反應體系中，選用COBE作為模型底物，重組菌EcoliM15(pQE30-ALR)能夠催化COBE不對稱還原為純手性的R-CHBE，e.e.值高達

4、100％，產(chǎn)率為98.5％；而利用赭色擲孢酵母催化的產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e.值分別只有64.5％和63.5％。成功地解決了用酵母細胞催化COBE還原時產(chǎn)物e.e.較低的問題?？疾炝溯o酶及共底物、底物和產(chǎn)物濃度、pH值、溫度以及菌體密度等因素對反應的影響。結果表明，由重組菌催化的不對稱還原必須在輔酶NADPH和輔酶再生酶系及輔底物葡萄糖的參與下才能進行；底物和高濃度的產(chǎn)物對還原反應有抑制作用；當pH＞6.0時，反應的轉化率及產(chǎn)率都會顯著降低；高

5、密度重組細胞可以減少底物的抑制作用；通過分批加入底物的方式可以有效緩解水相體系底物的抑制，產(chǎn)物濃度可達90mmol/L。 二、為了解決重組菌M15(pQE30-ALR)催化還原反應中還原型輔酶NADPH不足的問題，分別從巨大芽孢桿菌B.megateriumAS1.223和B.megateriumAS1.151中克隆到了兩個葡萄糖脫氫酶(glucosedehydrogenase，GDH)基因gdh151和gdh223，并構建了重組

6、菌EcoliM15(pQE30-gdh223)和M15(pQE30-gdh151)。對這兩個重組菌進行誘導表達，結果發(fā)現(xiàn)前者的GDH比酶活是后者的11倍。對兩個葡萄糖脫氫酶氨基酸序列分析結果發(fā)現(xiàn)，GDH223與GDH151僅有一個氨基酸差異，即GDH223的Arg39和GDH151的Ser39的差異。由于Arg39是葡萄糖脫氫酶催化NADP+還原活性中心必不可少的部分，正是因為這個差異造成重組菌M15(pQE30-gdh151)表達的G

7、DH151酶蛋白失活。對重組菌M15(pQE30-gdh223)培養(yǎng)和誘導條件進行了優(yōu)化，比酶活可達4.45U/mg，單位體積發(fā)酵液酶活可達31U/mL。在此基礎上對重組菌M15(pQE30-gdh223)產(chǎn)生輔酶和催化輔酶再生的能力進行了考察，證實重組菌表達的酶蛋白具有與商品酶同樣的輔酶再生能力。初步驗證了重組菌M15(pQE30-gdh223)作為輔酶NADPH的再生系統(tǒng)，分別在與重組菌M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不

8、對稱還原反應及與丙酮干細胞協(xié)同催化COBE還原反應中起到提供輔酶和輔酶再生的作用。所構建的輔酶NADPH再生系統(tǒng)簡單而且有效，可以應用于其它生物不對稱催化還原體系。 三、研究了由重組菌M15(pQE30-gdh223)與重組菌M15(pQE30-ALR)耦合系統(tǒng)催化COBE不對稱還原反應的特點，考察了水相反應體系中，底物濃度、雙菌的質量比、葡萄糖濃度、溫度和轉速對雙菌反應體系的影響。結果表明，底物濃度對雙菌轉化反應有一定的抑制，

9、[COBE]＞60mmol/L，產(chǎn)物產(chǎn)率明顯降低；當葡萄糖濃度為200mmol/L、溫度為34℃、搖床轉速100r/min，M15(pQE30-ALR)與M15(pQE30-gdh223)濕細胞質量比為4：1的情況下，有最高的轉化效率。采用分批流加底物的操作方法，產(chǎn)物終濃度達到124mmol/L。初步研究了在鄰苯二甲酸二丁酯/磷酸鉀緩沖液兩相體系中，雙菌體系在當初始底物濃度為360mmol/L時，產(chǎn)物總濃度為283mmol/L，產(chǎn)率達到

10、了78.6％。兩相體系可以有效地緩解底物和產(chǎn)物的抑制，但是對產(chǎn)物的e.e.值降低到了87％。 四、分別研究了有輔酶參與的重組菌表達醛基還原酶和葡萄糖脫氫酶催化雙底物反應的動力學，結果表明，兩個反應都可以用OrderedBiBi反應機理描述，并從實驗數(shù)據(jù)回歸得到了動力學公式的常數(shù)，所得到的醛基還原酶(ALR)和葡萄糖脫氫酶(GDH)酶催化反應動力學方程可分別表示為： vALR=1.85[NADPH][COBE]/[NADP

11、H][COBE]+0.273[COBE]+0.21[NADPH]+0.218vGDH=22.327[NADP+][glu]/[NADP+][glu]+0.145[glu]+0.182[NADP+]+0.0473上述數(shù)學模型可以用于描述雙菌耦合體系催化COBE還原為(R)-CHBE的間歇過程。五、從木蘭假絲酵母(CandidamagnoliaZJU106)克隆得到了羰基還原酶(NADPH-dependentcarbonlyreducase

12、，CAR)的基因，并成功地在大腸桿菌中表達。在水相體系中，重組菌M15(pQE30-CAR)能催化COBE不對稱還原為單一手性純的(S)-CHBE，e.e.值約為100％。而用木蘭假絲酵母催化得到的產(chǎn)物e.e.值僅為57.5％。進一步考察了重組菌M15(pQE30-CAR)和重組菌M15(pQE30-gdh223)耦合體系催化COBE不對稱還原反應中的規(guī)律，結果表明，高濃度底物對反應有抑制作用，但不如重組菌M15(pQE30-ALR)那