醛酮還原酶TdAKR的克隆表達(dá)及催化合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的研究.pdf

1、手性醇是合成大量重要手性藥物的手型砌塊。(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((S)-CHBE)是一種多功能的手性中間體，尤其可作為降血脂藥物阿托伐他汀鈣的關(guān)鍵中間體。由于生物催化不對(duì)稱還原法生產(chǎn)(S)-CHBE具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)映體選擇性高、副產(chǎn)物少，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已越來越受到人們的重視。本論文從Torulaspora delbrueckii ZJB15080中得到一個(gè)醛酮還原酶基因，并對(duì)它做了一系列的研究。主要研究結(jié)果如下:

2、>　　1.通過基因挖掘從T.delbrueckii ZJB15080中克隆了一株醛酮還原酶TdAKR，將其于大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，純化后進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。TdAKR分子量約為38.6kDa，最適溫度與最適pH分別為30℃、7.0。在低于35℃和偏酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好。TdAKR遵循強(qiáng)制順序反應(yīng)。對(duì)4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的最大反應(yīng)速率(vmax)和對(duì)NADPH、COBE的表觀米氏常數(shù)（Km）

3、以及周轉(zhuǎn)數(shù)(kcat）分別為47.51U·mg-1，0.07mM、1.19mM和30.56s-1。
　　2.對(duì)重組菌的產(chǎn)酶表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定了最佳產(chǎn)酶表達(dá)條件為:接種量2％，加入培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2h后加入9g·L-1的乳糖，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間分別為28℃和12h。此時(shí)比酶活達(dá)1932.6U·g-1，生物量為1.92g·L-1(DCW)。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分，確定了加入10g·L-1的蔗糖和5g·L-1的NaNO3可使比酶活提高

4、到2374.35U·g-1，生物量2.1g·L-1(DCW)。
　　3.研究了TdAKR與EsGDH雙酶偶聯(lián)體系不對(duì)稱還原COBE生成(S)-CHBE的過程。在50g·L-1的底物濃度條件下，轉(zhuǎn)化2h后產(chǎn)物得率為91.5％，e.e.值95.6％，時(shí)空產(chǎn)率549g·L-1·d-1。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5g·L-1時(shí)，反應(yīng)3h后達(dá)到平衡，得率為90.3％，e.e.值95.7％，時(shí)空產(chǎn)率541.8g·L-1·d-1。在底物濃度進(jìn)一步增大為10