天冬酰胺酶在醫(yī)藥中的應用

1、XXXXXXXXXXX,L-天冬酰胺酶 在醫(yī)藥中的應用,酶在醫(yī)藥方面主要的應用,1 用酶進行疾病的診斷2 用酶進行疾病的治療3 用酶制造各種藥物,藥用藥用酶的一般要求酶的一般要求,1 在機體內的生理條件下具有較高活力和穩(wěn)定性；2 對底物有較高親和力,不受產物和體液中正常成分抑制；3 在體內有較長的半衰期，可緩慢地被分解或排出體外；4 不需要外源性輔助因子；5 在生理條件下酶促反應不可逆；6 酶制劑純度高，

2、不含其它毒性雜志，來自非致病性酶源。,,酶在疾病治療方面的應用,對治療白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶是第一種用于治療癌癥的酶。 當L-天冬酰胺酶注射進入人體后，人體正常細胞內由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白質合成不受影響。而對于缺乏天冬酰胺合成酶的癌細胞來說，由于本身不能合成L-天冬酰胺，外來的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此蛋白質合成受阻，從而導致癌細胞死亡。

3、 注射天冬酰胺酶時，可能出現(xiàn)過敏反應，偶爾還可能出現(xiàn)過敏性休克，但停藥后，這些副作用會消失。故此，在注射L-天冬酰胺酶之前，應做皮試。在一般情況下，注射該酶可能出現(xiàn)的過敏性反應包括發(fā)熱、惡心、嘔吐、體重下降等。對比起可怕的白血病來，這些副作用是輕微的痛苦，在未找到其他更好的治療方法之前是可以接受的。,概述：L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥的應用,中文名稱： L-天冬酰胺英文名稱： L-Asparagine 分子式： C4H8N2O3 線

4、性分子式： H2NCOCH2CH(NH2)CO2H 分子量： 132.12,,L-天冬酰胺酶,1．性質 L-天冬酰胺酶（L-asparaginase , L-ASP ），廣泛存在于微生物、植物和部分嚙齒類動物的血清中，為白色結晶粉末，微有濕性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有機溶劑。 對熱穩(wěn)定性好，在溫度50℃下，15min后，活性降低30%，60℃下，1小時內失活。凍干品在2~

5、5℃可穩(wěn)定數(shù)月，但其溶液只能保存數(shù)日，20℃儲存7天，5℃儲存14天均不減少酶的活力。最適宜在pH值為8.5，溫度在37℃下儲存。 純酶的分子量從130000到140000不等。,2．用途 L-天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，為抗腫瘤酶制劑。腫瘤細胞不能合成生長必需的天冬酰胺而使其生長受到限制。正常細胞能合成天冬酰胺，故受影響較少。 因此，天冬酰胺酶是一種對腫瘤細胞有選擇性的抑制藥物。對急性淋巴細

6、胞白血病的緩解率在50%以上，對急性粒細胞性白血病和急性單核細胞白血病有一定療效，缺點是單獨使用不僅緩解期短，切易產生耐藥性。該藥對肌體免疫也有抑制作用，它還可用于治療皮肌炎。在動物實驗中，本品對實體瘤和白血病均有效，且與常見巰嘌呤、甲蝶呤、長春新堿、阿糖胞苷等無交叉耐藥現(xiàn)象。,3．生產工藝過程 L-天冬酰胺酶是用微生物發(fā)酵法生產的酶制劑，其工藝過程如下： 在每一步的生產過程中特別要注意控制好溫度、

7、時間和溶液的酸堿值，以保證菌種培養(yǎng)和發(fā)酵等過程的適宜條件。,抗腫瘤制劑L-天冬酰胺酶及在治療白血病中的研究,1、白血病介紹2、 L-天冬酰胺酶臨床應用3、 L-天冬酰胺酶結構與功能4 、L-天冬酰胺酶的純化與修飾5、 L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥上的進展,目錄,1.1概述 白血病（Leukemia）是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病?？寺≈械陌籽〖毎鲋呈Э?，分化障礙，凋亡受阻。1.2特征 白細胞

8、呈惡性、無限制地增生，浸潤全身各組織和臟器，周圍血液血細胞有量和質的變化。抑制紅細胞和血小板止血的產生，非常容易受傷、出血、感染。,1、白血病介紹,1.3分類 臨床上分為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）、急性非淋巴細胞白血病（ANLL）、慢性粒細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病。1.4死亡率 慢淋白血病發(fā)病在50歲以后，才明顯增多 急性白血病若不經特殊治療，其平均生存期可能只有三個月左右。,2、L-天冬酰胺酶的

9、臨床應用,L-天冬酰胺酶（L-asparaginase, L-ASP，EC.3.5.1.1），商品名為左旋門冬酰胺酶，目前在臨床上已經被用于急性淋巴細胞白血?。╟hildhood Actute lymphoblastic leukemia, ALL）的治療。L-ASP單獨使用時，對ALL的有效率為60%，與長春堿（vincristine）及皮質甾類藥物（corticosteroids）聯(lián)合使用時，對ALL的有效率高達95%。

10、 另外，L-ASP對單細胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性網(wǎng)狀皮層組織增多癥以及慢性髓細胞白血病也有一定的療效，對胰腺癌細胞的增多還有一定的抑制作用，是臨床治療白血病的重要物質。,3、L-天冬酰胺酶結構與功能,3、L-天冬酰胺酶結構與功能,3、L-天冬酰胺酶結構與功能,L-ASP結構中與催化活性相關位點的研究 L-ASP用于臨床以來，人們對其分子結構與催化活性間的關系進行深入的研究。L-ASP結果中已經被研究過的位點包括T12、

11、Y25、S58、T89、N248等，L-ASP的活性中心由T12、Y25、S58、T89、D90。,L-天冬酰胺酶的作用機制,L-ASP抗腫瘤的作用機制在于它能降低人體內L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的濃度，這兩種氨基酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細胞缺乏天冬氨酰合成酶，不能合成L-天冬酰胺，需要攝取外源L-天冬酰胺才能存活。當外源L-天冬酰胺被分解掉時，癌細胞合成核苷酸和戴白騅·蛋白質的能力就會顯著降低，因此L-AS

12、P能有效的抑制腫瘤細胞的增值。 L-天門冬酰胺是某些腫瘤細胞生長必不可少的氨基酸，對人體正常細胞而言 自身具有合成L-天門冬酰胺的能力，而腫瘤細胞缺乏天門冬酰胺合成酶不能合成天門冬酰胺，其細胞需要從外源的L-天門冬酰胺攝取才能存活。L-ASP 能催化水解L-天門冬酰胺生成L-天門冬氨酸和氨，因此能夠有效地抑制癌細胞的生長，最終使癌細胞消亡。,L-天冬酰胺酶的分離純化,將L-ASP與高效先導序列pelB融合使得L-ASP在

13、細胞外表達，并在L-ASP的N末端添加了6個組氨酸序列標簽，然后采用Ni-NTA親和層析法分離純化得到L-ASP，成本高，并不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產。 經蔗糖破壁、(NH4)2SO4分級沉淀、透析、DEAEDE52、Q Sepharose Fast Flow等步驟純化得到的L-ASP比活力高達U/mg，SDS-PAGE檢測時顯示為一條帶，RT-HPLC分析純達到99%，最終回收率為50.5%，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產的要求

14、。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,L-天冬酰胺酶的修飾 L-ASP的聚乙二醇化不但降級了胰蛋白酶對它的降解作用，而且修飾酶的抗原性與天然酶相比也大為下降。 此外，聚乙二醇化L-ASP與傳統(tǒng)的脂質體化L-ASP相比與有明顯的優(yōu)勢。,微囊化修飾 將L-天冬酰胺酶用半透膜性質的聚合物制成微囊型固定化酶。其大小一般為1～ 500Lm。 低分子底物可以自

15、由出入膠囊膜, 與酶接觸而起反應, 反應產物則因濃度不斷增加而不斷滲透出膠囊外面。 囊型固定化可以克服天然酶針劑出現(xiàn)的抗體抗原反應 該注射到人體后, 對膜具有良好通透性的低分子底物, 能長時間發(fā)揮作用, 比天然酶的 療效好, 而且急性毒副反應也較低。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,用固定化酶反應器進行體外循環(huán)凈化血液中L -天冬酰胺 方法： 將固定化L -天冬酰胺酶裝填于柱中或將其固定在酶板、酶

16、管或血液透析膜上, 使血液從固定酶上通過, 除去癌細胞生長所需的L 2天冬酰胺, 從而達到治療的目的。 改進的功能： 由于酶不與體內器官直接接觸, 也就不會發(fā)生毒性和過敏反應。 具有天然酶的高度專一性及溫和條件下高效催化的特點, 還具有一定的機械強度; 酶經固定化后, 穩(wěn)定性有較大的提高, 可以反復使用也可儲存較長時間。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,1 Erwinase獲準用于治療對大腸桿菌源性天冬酰胺酶

17、過敏的急性淋巴細胞性白血病患者,注：Erwinase：歐文氏菌源性的天冬酰胺酶,5、 L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥上的進展,2011年11月18日，EUSA制藥和美國食品藥品管理局(FDA)宣布孤兒藥Erwinase獲準用于治療對大腸桿菌源性的天冬酰胺酶有超敏反應的急性淋巴細胞性白血病(ALL)患者。 Erwinaze是一種可降低循環(huán)血液中天門冬酰胺水平的天冬酰胺酶。天門冬酰胺是細胞生長的必需氨基酸，將其從血液中清除可抑制ALL相關

18、細胞的生長。天冬酰胺酶產品來源于細菌，近15%~20%的患者可對大腸桿菌源性的現(xiàn)代制劑產生超敏反應因而無法持續(xù)治療。Erwinaze是由歐文氏菌產生的，在免疫學性質上有別于原有的制劑，適用于對大腸桿菌源性治療有超敏反應的患者。 FDA批準Erwinase是基于相關的多項臨床試驗結果，共涉及630例ALL患者。在一項納入58名受試者的關鍵性療效研究中，100%的可評估患者達到了天冬酰胺酶活性主要終點。 Erwina

19、ze的不良反應：過敏反應、胰腺炎、轉氨酶和膽紅素水平升高、血栓形成、出血、高血糖癥、惡心和嘔吐。,2 靜脈注射天冬酰胺酶對于55歲左右新診斷急性成淋巴細胞白血病誘導緩解期治療的藥效動力學以及安全性,與兒童相比，天冬酰胺酶成人治療的藥代動力學、藥效學以及安全性信息非常有限。研究人員采用單次靜脈注射天門冬酰胺酶(2000 IU/m(2))作為25例成人患者誘導緩解的線藥物，并在幾個時間點獲得血清樣本。結果可見，天門冬酰胺酶活性血清峰濃度的

20、總體均值為1 IU/ml，消除半衰期為7天，分布容積為2.43 L/m(2)。單劑量給藥后，患者2小時后完全去氨基，并分別在14、21和28天完成100%、81%和44%。 藥效動力學相關模型顯示，0.2 IU/ml的最小酶活性最適天門冬酰胺酶消除。動態(tài)的POSTHOC分析顯示酶活性可以持續(xù)3個星期或更長。1例患者在給藥后22天產生了抗天門冬酰胺酶抗體。天門冬酰胺酶耐受性很好，很少出現(xiàn)3/4級不良反應。未觀察到過敏反應或胰