葉位和天冬酰胺合成酶基因的抗病調(diào)控功能分析.pdf

1、植物天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，ASN，EC6.3.5.4)是一類小家族基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶。它利用ATP水解的能量，主要以谷氨酰胺為氮源酰胺化天冬氨酸，催化天冬酰胺的生物合成。天冬酰胺是植物氮轉(zhuǎn)運(yùn)的主要形式。所以，ASN在植物的氮代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用，而代謝影響植物抗病性，因此，可以想象，ASN對植物抗病性也應(yīng)有顯著的影響。但到目前為止，有關(guān)ASN對植物抗病性調(diào)控作用的報(bào)道還很罕見。另一方面，

2、植物抗病性評價(jià)離不開病原物接種分析，來自病原物、環(huán)境條件和植物本身的諸多因素都可能影響到接種分析的結(jié)果，例如接種體數(shù)量和活性，環(huán)境溫度、濕度和光照，植株年齡、葉片的生長狀態(tài)和葉位等。本研究首先分析了葉位對植物抗病性的影響及其機(jī)制，優(yōu)化了接種體系，進(jìn)而采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced genesilencing，VIGS)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析了番茄ASN基因的抗病調(diào)控功能。此外，鑒定了一批ASN轉(zhuǎn)基因水稻，為深入研究ASN功

3、能及其作用機(jī)制積累材料。本研究獲得了如下結(jié)果:
　　(1)明確了葉位對植物抗病性具有顯著影響，并初步探索了葉位相關(guān)抗病性(Leaf-associated disease resistance)的產(chǎn)生分子機(jī)制。通過對3種植物與4種病原物之間7種植物-病原物互作體系產(chǎn)生的3類不同抗病性(基礎(chǔ)抗性(Basalresistance)、效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫(Effector-triggered immunity, ETI)和非寄主抗性(Non

4、host resistance))的分析，明確了葉位對植物抗病性的影響廣泛存在，但具體的影響作用因植物-病原物互作體系而異。對于擬南芥和普通煙對核盤菌（Sclerotinia sc lerotiorum）的基礎(chǔ)抗性，本氏煙對野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci，Pstab)的抗性以及擬南芥RPS2介導(dǎo)的對P.syringae pv.tomato(Pst)DC3000(AvrRpt2+)的ETI，上葉位葉

5、片（擬南芥成葉與莖生葉）的抗性強(qiáng)于下葉位葉片（擬南芥幼葉）。然而，對于本氏煙和擬南芥對水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)的非寄主抗性以及本氏煙對Pst DC3000的非寄主抗性，趨勢卻恰恰相反。微陣列基因表達(dá)譜分析結(jié)果表明，不同葉位的擬南芥葉片中數(shù)百基因的表達(dá)具有顯著差異，這些基因涉及到植物的防衛(wèi)反應(yīng)，植物激素的合成、代謝與信號傳導(dǎo)，細(xì)胞壁的形成與加固及鈣離子信號傳導(dǎo)等方面。一組擬南芥激素突

6、變體，包括水楊酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)突變體sid1和sid2-3、乙烯信號傳導(dǎo)突變體ein2、茉莉酸信號傳導(dǎo)突變體jar1-1以及脫落酸合成突變體aba1與aao3，喪失了葉位介導(dǎo)的對核盤菌的抗病性。乙烯信號傳導(dǎo)突變體ein2、ein3-1和eto2-1與水楊酸轉(zhuǎn)運(yùn)突變體sid1不同葉位葉片產(chǎn)生的RPS2/AvrRpt2+介導(dǎo)的HR嚴(yán)重度與野生型植株呈相反的趨勢。水楊酸合成突變體sid2-3不同葉位葉片產(chǎn)生的Xoo誘導(dǎo)的HR嚴(yán)重度也與野生型植株呈

7、相反的趨勢。這些結(jié)果揭示植物激素在葉位介導(dǎo)的各種抗病性中起重要調(diào)控作用，而且對于不同的植物-病原物互作系統(tǒng)，參與調(diào)控作用的激素各不相同。這些結(jié)果還表明，為評價(jià)基因功能進(jìn)行接種分析時(shí)應(yīng)選用同齡植株的同樣葉位葉片進(jìn)行對比分析。
　　(2)在基因組水平鑒定了番茄與本氏煙ASN基因家族。采用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)介導(dǎo)的VIGS技術(shù)研究明確了兩個(gè)番茄ASN基因?qū)Σ煌愋涂共⌒缘膹V泛調(diào)控作用。生物信息

8、學(xué)分析結(jié)果顯示，番茄與本氏煙ASN基因家族分別由2個(gè)和6個(gè)基因構(gòu)成，均可分成兩類。SlASN1基因的沉默降低了番茄植株對Pst DC3000和核盤菌的抗性，但提高了對瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)的抗性以及Cf-4/Avr4介導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)，卻不影響對TRV的抗性以及Xoo誘導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng);而SlASN2基因的沉默降低了番茄植株對TRV、Pst DC3000和核盤菌的抗性，但提高了對瓜果腐霉(P.apha

9、nidermatum)的抗性，卻不影響對Cf-4/Avr4介導(dǎo)的和Xoo誘導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)。該結(jié)果說明，這兩個(gè)番茄ASN基因均正調(diào)控番茄對Pst DC3000與核盤菌的抗性以及負(fù)調(diào)控對瓜果腐霉的抗性，但對某些抗病性，包括對TRV的抗性和Cf-4/Avr4介導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)的調(diào)控作用，兩者有顯著差異。此外，SlASN1基因的沉默不影響SlASN2基因的表達(dá)，但SlASN2基因的沉默導(dǎo)致SlASN1基因的表達(dá)上調(diào)了4.1倍。該結(jié)果表明，

10、SlASN2可能對SlASN1基因的表達(dá)有一定抑制作用。
　　(3)構(gòu)建獲得了過量表達(dá)SlASN2基因(SlASN2-OE)的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并利用T2轉(zhuǎn)基因植株研究明確了SlASN2基因?qū)χ参锟共⌒缘恼{(diào)控作用。創(chuàng)建并獲得了SlASN2-OE轉(zhuǎn)基因煙草3個(gè)株系，其中2株表型與野生型具有顯著差異，葉片卷曲，畸形，新葉壞死，并且莖稈出現(xiàn)水漬狀壞死，最后不能成活。另一個(gè)株系表型與野生型無顯著差異。經(jīng)qRT-PCR檢驗(yàn)，3株SlASN2-

11、OE植株中的SlASN2基因表達(dá)均強(qiáng)烈高于野生型，但彼此之間并無顯著差異。成活下來的陽性SlASN2-OE轉(zhuǎn)基因植株T2代用于功能分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了對核盤菌、野火病菌、TMV和CMV的抗性，但降低了對瓜果腐霉的抗性，卻不影響對南方根結(jié)線蟲的抗性以及對Cf-4/Avr4介導(dǎo)的和Xoo誘導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)。表明SlASN2基因正調(diào)控植物對核盤菌、野火病菌、TMV和CMV的抗性，但負(fù)調(diào)控對瓜果腐霉的抗性。這些結(jié)果與番茄VIGS功

12、能分析結(jié)果一致。此外，SlASN2-OE轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了對0.4 M NaCl脅迫的耐性，表明SlASN2基因?qū)χ参锬望}性也可能起一定正調(diào)控作用。
　　(4)對實(shí)驗(yàn)室獲得的水稻ASN基因的超表達(dá)與RNAi轉(zhuǎn)基因水稻T4代植株，采用GUS染色、潮霉素抗性鑒定以及植株生長表型觀察分析等方法進(jìn)行了陽性植株篩選和鑒定，獲得的轉(zhuǎn)基因株系為ASN基因功能的深入分析積累了研究材料。GUS染色與潮霉素抗性檢測結(jié)果顯示，OsASN4-3、OsASN