甜菜谷氨酰胺合成酶基因克隆及其對氮素響應(yīng).pdf

1、糖用栽培甜菜是世界和我國兩大糖料作物之一，又是我國北方特有的糖料作物。而甜菜對氮素的吸收利用能力是生長發(fā)育重要的限制因素之一。谷氨酰胺合成酶(GS)在高等植物氮代謝中起著重要的作用，是氮代謝的關(guān)鍵酶。GS具有多種同工酶，根據(jù)亞細胞定位，分為胞液型谷氨酰胺合成酶(GS1)和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶(GS2)。研究甜菜GS基因的結(jié)構(gòu)功能及表達調(diào)控對甜菜實現(xiàn)高同化氨及增產(chǎn)增糖有重要意義。本研究以糖用栽培甜菜為試材，利用RT-PCR方法進行甜菜胞液

2、型谷氨酰胺合成酶mRNA(GS1mRNA)、質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶mRNA(GS2mRNA.)和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶的基因組基因(GS2DNA)的分離克隆。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段對GS1mRNA和GS2mRNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測；利用酶活測定和半定量PCR相結(jié)合的方法對GS1mRNA和GS2mRNA在氮素和核酸蛋白合成抑制劑(放線菌素D和放線菌酮)處理下的表達進行分析。通過上述研究得到以下結(jié)果：

3、⑴運用PCR擴增技術(shù)首次克隆了甜菜質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶的基因組基因GS2DNA(登錄號為EU558132)。測序結(jié)果表明，基因組DNA長度為6144bp，含有13個外顯子和12個內(nèi)含子，最大的內(nèi)含子長度為1576bp，最小的長度為89bp。 ⑵利用RT-PCR方法成功地從甜菜葉片中克隆了已知谷氨酰胺合成酶基因GS1mRNA(登錄號為AF343667)和GS2mRNA(登錄號為AY026353)。獲得的GS1cDNA基因長度為10

4、71bp，與已知的GS1mRNA相似性達99.81％，只有2個堿基的差異。GSlcDNA基因可編碼356個氨基酸，而且其推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它植物GS1基因的具有較高的同源性。獲得的GS2cDNA基因長度為1296bp，與已知的GS2mRNA相似性達99.92％，只有1個堿基的差異。GS2cDNA基因可編碼431個氨基酸，而且其推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它植物GS2基因的也具有較高的同源性。 ⑶用ExPasy軟件包和TOPPRED

5、在線分析GS的理化特性，結(jié)果表明GS1的理論等電點PI=5.30，蛋白質(zhì)相對分子量Mw=39092Da，GS2的理論等電點PI=5.91，蛋白質(zhì)相對分子量Mw=47422Da，二者均為易溶、親水性強的蛋白。并運用DNAMAN6.0軟件構(gòu)建了GS的系統(tǒng)進化樹，GS1隸屬于胞液型GS家族，和胡頹子GS1的同源性很近；GS2隸屬于質(zhì)體型GS家族，與菠菜GS2的親緣關(guān)系最近。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GS1的α螺旋在24.72％左右，β折疊在16.

6、01％左右，GS2的α螺旋在24.13％左右，β折疊在16.01％左右，表明GS為混合型蛋白。另外，應(yīng)用同源建模法Geno3d進行GS三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，GS1的β折疊區(qū)有19個折疊，折疊區(qū)間由α螺旋來連接，共有10個螺旋，GS2的β折疊區(qū)有10個折疊，折疊間由α螺旋連接，共有12個螺旋。氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析顯示GS蛋白包含了一個GSbeta-Graspdomain和一個GScatalyticdomain，這些功能區(qū)在植物的谷氨酰胺合成酶中

7、是保守的，均為Gln-synt結(jié)構(gòu)域。 ⑷不同氮形態(tài)比例的氮源對GS1和GS2基因表達的影響規(guī)律和GS活性變化規(guī)律基本一致。NO-3-N:NH+4-N=80:20和NO-3-N:NH+4-N=50:50的處理最能促進GS基因的表達，NO-3-N:NH+4-N=0:100對GS基因誘導(dǎo)作用最差。即混合態(tài)氮有利于甜菜GS基因的表達，單一種類的氮作用較差，而單一硝態(tài)氮則較單一銨態(tài)氮好。 ⑸經(jīng)過氮素誘導(dǎo)后，不同放線菌素D和放線菌