低鹽脅迫下凡納濱對蝦消減cDNA文庫構(gòu)建及谷氨酰胺合成酶cDNA克隆和表達.pdf

1、本研究采用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了低鹽脅迫誘導(dǎo)下凡納濱對蝦肝胰腺消減cDNA文庫，對cDNA文庫中差異表達序列標(biāo)簽(ESTs)進行同源比對、功能分類和鑒定分析，進一步對文庫中差異表達的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)進行了全長克隆及序列分析，同時深入研究了低鹽脅迫對凡納濱對蝦GS的時空表達、GS活性、谷氨酰胺含量、血淋巴

2、氮代謝的影響。研究結(jié)果如下：
　　1.低鹽脅迫下凡納濱對蝦肝胰腺消減cDNA文庫構(gòu)建及差異ESTs分析
　　文庫中的克隆測序后獲得162個有效ESTs，經(jīng)CP3在線拼接后獲得21contigs和110singlets，共131個非重復(fù)序列。比對結(jié)果顯示，在131個非重復(fù)序列中，41個非重復(fù)序列與Genbank中的已知基因的序列有較高的同源性。
　　根據(jù)GO(geneontology)分類法，所獲得的41個非重復(fù)序列共分

3、為7類，分別為蛋白質(zhì)代謝及過程、碳水化合物代謝及能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運、細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞防疫和體內(nèi)平衡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他，所占比例分別為所占比例分別為27.5％、15.0％、17.5％、10.0％、12.5％、7.5％、10.0％。蛋白質(zhì)代謝及過程類序列所占比例最高，其次為轉(zhuǎn)運類序列。
　　2.凡納濱對蝦谷氨酰胺合成酶的cDNA克隆及序列分析
　　本實驗根據(jù)消減cDNA文庫中篩選獲得的GS EST設(shè)計特異性引物，采用cDNA末端快

4、速擴增法成功克隆了凡納濱對蝦GS cDNA全長序列，共計1455 bp，包括56 bp5’非編碼區(qū)，1101bp閱讀框以及298 bp3’非編碼區(qū)。閱讀框共編碼366氨基酸，分子量計算值為40.92 kDa，理論等電點為6.34，氨基酸序列有兩個模式位點，分別位于61-81 aa和243-259 aa。序列多重比對結(jié)果表明，凡納濱對蝦GS氨基酸序列有5處保守位點，與中國明對蝦同源性達93％、與眼斑龍蝦GS同源性達86％及與長牡蠣同源性達

5、73％。采用NJ法構(gòu)建的GS系統(tǒng)進化樹表明，LvGS分類地位處于無脊椎動物支，與無脊椎動物親緣性較近，與脊椎動物親緣性較遠。
　　3.低鹽脅迫對凡納濱對蝦GS表達量、活性、谷氨酰胺含量和氮代謝的影響
　　低鹽脅迫誘導(dǎo)下肝胰腺、腸、鰓和胃中GS mRNA表達量上調(diào)，心臟、肌肉和眼柄中GS mRNA表達量下調(diào)。低鹽脅迫下，肝胰腺中LvGS表達量先升高后下降，LvGS表達量在6h、12h、1d和2d顯著高于對照組(P<0.05)；

6、肝胰腺中GS活性和谷氨酰胺含量有先升高后降低的趨勢，與對照組差異不顯著；血淋巴總蛋白和血氨有先降低后升高的趨勢，與對照組差異不顯著；血淋巴尿素氮有先升高后降低的趨勢，低鹽脅迫下3h和12h，血淋巴尿素氮顯著高于對照組(P<0.05)；血淋巴尿酸有先升高后降低的趨勢，低鹽脅迫下3h、6h、12h、2d和3d，血淋巴尿酸顯著高于對照組(P<0.05)。LvGS表達量、GS活性、谷氨酰胺含量、血氨、尿酸和尿素在低鹽脅迫下7d-30d趨于恢復(fù)正