龍須菜谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能研究.pdf

1、谷氨酰胺合成酶（GS）是植物氮素同化途徑中最為關(guān)鍵的催化酶之一，被認(rèn)為是植物中無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的“門戶”，對(duì)植物氮素吸收、同化和利用效率有著極為重要的影響。植物中GS同工酶分為兩種：一種是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的胞質(zhì)型GS1，主要同化從土壤中吸收的初級(jí)氨及再同化植物體內(nèi)各氮循環(huán)途徑所釋放的氨；另一種是位于葉綠體（或質(zhì)體）內(nèi)的質(zhì)體型GS2，同化由NO3--N還原而來(lái)的氨及光呼吸過程中釋放的氨。氮素供應(yīng)對(duì)龍須菜生長(zhǎng)發(fā)育和瓊膠產(chǎn)量有著非常重要的影響，

2、目前龍須菜氮代謝的研究還停留在氮營(yíng)養(yǎng)生理層面，在分子機(jī)理水平的研究報(bào)道很少，尤其是對(duì)氮同化和利用效率緊密相關(guān)的GS基因的研究還是空白。
　　因此，本文以龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從龍須菜中克隆得到了3個(gè)谷氨酰胺合成酶基因，分別命名為GlGS1-1、GlGS1-2和GlGS2。利用生物信息學(xué)手段對(duì)其主要結(jié)構(gòu)特征和功能特征進(jìn)行了分析。GlGS2 cDNA全長(zhǎng)1385bp，含有一個(gè)長(zhǎng)1209b

3、p，編碼402個(gè)氨基酸的開放閱讀框，推測(cè)的多肽分子量為43.9kDa。GlGS1-1全長(zhǎng)為1209bp，開放閱讀框長(zhǎng)1053bp，編碼350個(gè)氨基酸的多肽，推測(cè)的多肽分子量大小為38.3kDa。GlGS1-2cDNA全長(zhǎng)1257bp，編碼350個(gè)氨基酸的開放閱讀框長(zhǎng)1053bp，推測(cè)的多肽分子量大小為38.7kDa。氨基酸序列分析顯示GlGS1-1、GlGS1-2和GlGS2蛋白具有植物GS同工酶的典型結(jié)構(gòu)特征：內(nèi)含一個(gè)GS beta-

4、Grasp域和一個(gè)GS catalytic域，以及分別存在于這兩個(gè)域中的兩個(gè)活性中心：一個(gè)GS指紋區(qū)和一個(gè)GS ATP結(jié)合區(qū)。通過亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)GlGS1-1、GlGS1-2蛋白為胞質(zhì)型蛋白，在GlGS2多肽N-端有一個(gè)27個(gè)氨基酸殘基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這個(gè)多肽定位于葉綠體內(nèi)，表明GlGS2蛋白為葉綠體蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，GlGS2與一種單細(xì)胞紅藻Galdieria sulphuraria的GS基因在分子進(jìn)化關(guān)系上最相近，提示二者可能是同

5、源進(jìn)化的結(jié)果。GlGS1-1和GlGS1-2最相近，它們可能由某一共同祖先基因經(jīng)重復(fù)和突變產(chǎn)生。
　　為了對(duì)龍須菜GlGS2所編碼的GS酶的生化功能和屬性有準(zhǔn)確的了解，本實(shí)驗(yàn)將GlGS2去除跨肽cTP序列的GlGS2編碼區(qū)（GlGS2-cTP）插入到載體pET30a(+)中，成功構(gòu)建表達(dá)載體GlGS2-cTP-pET30a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），0.25mM IPTG誘導(dǎo)，在15℃培養(yǎng)過夜，菌體表達(dá)活性蛋白量最大。

6、用Ni-NTA親和色譜法純化得到了各對(duì)應(yīng)的重組蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組的去除跨肽cTP序列的GlGS2編碼區(qū)蛋白的分子量為43kDa左右。分析重組蛋白質(zhì)的谷氨酰胺合成酶催化特性顯示，獲得的重組蛋白具有GS酶催化活性，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度和pH范圍內(nèi)，其最適溫度為37℃，最適pH為7.4，進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平證實(shí)GlGS2為谷氨酰胺合成酶基因。
　　本文以龍須菜為材料，在50μmol/L氮源（NH4+-N:NO3--N=2

7、:1）配制的人工海水中預(yù)培養(yǎng)兩周。設(shè)置不同氮形態(tài)比例的氮源：NH4+-N:NO3-N分別為50:0、40:10、25:25、10:40、0:50。取材并提取總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定龍須菜GlGS2、GlGS1-1、GlGS1-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，分析不同NH4+-N:NO3--N比例的氮源施養(yǎng)處理對(duì)龍須菜GlGS2、GlGS1-1和GlGS1-2表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示不同形態(tài)比例的氮源對(duì)龍須菜GlGS2、GlGS