谷氨酰胺合成酶對Escherichia coli和Pseudomonas putida生物膜形成的影響.pdf

1、生物膜（biofilms）是細菌吸附在有機或無機介質(zhì)上時，通過分泌含表面多糖、蛋白、DNA的細胞外基質(zhì)，將菌群包圍其中所形成的復合體。在自然界中，細菌主要以生物膜形態(tài)存在。生物膜結(jié)構(gòu)為內(nèi)部菌群提供了物理性防護，生物膜中的菌體可形成互養(yǎng)共棲關(guān)系協(xié)同進行新陳代謝，遺傳物質(zhì)可橫向轉(zhuǎn)移使得進化更快，生物膜的形成對微生物提供了生態(tài)學優(yōu)勢。 生物膜的形成受多種因素影響，外界環(huán)境條件如水文條件、吸附介質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、光照、溫度等，細菌內(nèi)在的調(diào)節(jié)

2、機制如密度感應(yīng)系統(tǒng)都可影響生物膜形成。與浮游態(tài)相比細菌在形成生物膜時多種基因差異表達，差異表達的基因包括細菌吸附過程、密度感應(yīng)系統(tǒng)、代謝、應(yīng)答環(huán)境壓力、分子伴侶相關(guān)的基因。 在前期實驗中通過蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）與浮游態(tài)相比在生物膜形成過程中有多個基因差異表達，本實驗選取其中一個差異表達的蛋白--谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）通過該基因的

3、過量表達、抑制和敲除以研究其對生物膜形成的影響。 本文用恒流器模擬自然界中流體環(huán)境，以低營養(yǎng)的Hutner鹽液為培養(yǎng)基，以載玻片為吸附介質(zhì)培養(yǎng) Pseudomonas putida和 Escherichia coli，培養(yǎng)溫度30℃，儲液罐進液流速15mL/h，空氣進入速度14-16mL/s，使其在載玻片上形成生物膜。通過顯微鏡觀察生物膜形成過程。P．putida培養(yǎng)時間0-60h時為粘附聚集階段，60-84h為微菌落形成階段，

4、84h后為生物膜成熟階段。E．coli培養(yǎng)時間為0-72h時為粘附聚集階段，72-96h為微菌落形成階段，96h后為生物膜成熟階段。 通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得E．coli gln gene全長序列。利用PCR擴增出谷氨酰胺合成酶基因，將gln與質(zhì)粒pBC KS+連接構(gòu)建出gln gene表達載體pBC KS-glnhb，并進行表達。利用恒流器培養(yǎng)E．coli-pBC KS-glnhb形成生物膜，觀察其生物膜形成狀況。與E．coli同期

5、相比谷氨酰胺合成酶過量表達的菌體生物膜形成能力較弱，菌群的密度和厚度均有減少，谷氨酰胺合成酶的過量表達對生物膜形成有較大影響。 利用反義RNA與gln gene的mRNA互補結(jié)合后可干擾gln gene正常表達，本實驗將E．coli gln gene的反義鏈連接入質(zhì)粒，構(gòu)建出反義核酸載體pBCKS-glnbh，并轉(zhuǎn)入E．coli DH5α，轉(zhuǎn)化后的重組子可用于利用RNA干擾檢測谷氨酰胺合成酶不同表達對生物膜形成的影響。同時構(gòu)建出