中國明對蝦SWD抗菌肽、谷氨酰胺合成酶和Ras基因的表達與功能研究.pdf

1、甲殼動物集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖，特別是對蝦的養(yǎng)殖，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中增長最快的產(chǎn)品之一。盡管取得了巨大的成功，但是對蝦養(yǎng)殖業(yè)仍面臨著嚴重傳染性疾病暴發(fā)流行的危險，這給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。自上世紀90年代以來，商業(yè)化的對蝦養(yǎng)殖面臨著嚴重的打擊，病毒和弧菌引起的蝦病的暴發(fā)流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 疾病的爆發(fā)常由三種因素的相互作用引起，即惡化的環(huán)境、弱抵抗力的宿主、侵略性的病原菌。甲殼動物沒有獲得性免疫；但具有先天性免疫包括

2、酚氧化酶原系統(tǒng)激活引起的黑化作用，對外源物質(zhì)的凝結(jié)、吞噬作用和包囊作用，抗菌作用和細胞凝集作用。抗菌肽通常是小的陽離子分子，廣泛分布于整個生物王國，特別是對缺乏獲得性免疫的生物是必須的。 疾病的控制和生物安全目前被認為是影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的最關(guān)鍵因素。增強對蝦的先天免疫可以提高對病原微生物感染的廣譜抵抗力，激活或提高先天免疫系統(tǒng)能力的各種免疫增強藥物的活性被普遍認為是一個用于提高養(yǎng)殖對蝦的健康和抵抗流行病暴發(fā)很好的選擇。

3、免疫增強藥物是那些能夠刺激免疫反應和提高免疫系統(tǒng)抵抗感染和疾病能力的物質(zhì)。如β-葡聚糖能夠增強甲殼動物抵抗寄生蟲、細菌和病毒的感染能力。 來自對蝦自身的抗菌肽應用于預防控制對蝦疾病，即可以提高對蝦的先天免疫力、抵抗病原微生物的入侵，又可以確保生物安全，因此研究對蝦的抗菌肽，特別是具有雙重功能的抗菌肽具有重要意義。 抗菌肽在對蝦體內(nèi)行使功能不是獨立完成的，需要免疫系統(tǒng)和免疫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑的因子及其它因子的參與，因此研究

4、免疫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導機制中起作用的基因，了解對蝦的信號轉(zhuǎn)導通路在病原微生物入侵時在先天免疫中的作用具有重要意義，進而可以更好的了解對蝦抵抗病原微生物的機制。 目前的研究表明含有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有蛋白酶抑制活性或抗菌活性。對蝦同其它海洋無脊椎動物一樣，免疫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導機制目前研究的還比較少。 本研究對中國明對蝦含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽基因、中國明對蝦谷氨酰胺合成酶(Fc-GS)基因、中國明對蝦Ras基因進行了

5、克隆鑒定，并對其蛋白功能進行了初步探討，為進一步了解中國明對蝦的免疫防御機制和免疫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導機制提供理論依據(jù)。 一、中國明對蝦Fc-SWD的功能研究 對蝦依靠先天免疫系統(tǒng)生活于水生環(huán)境中并承受著各種壓力，如細菌、真菌、病毒的入侵?？咕牡纳珊歪尫攀堑挚惯@些病原菌入侵的重要免疫反應。 從中國明對蝦的血細胞中克隆到了一個含單一WAP結(jié)構(gòu)域的新型抗菌肽，命名為含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽。該抗菌肽cDNA全長

6、399bp，含有一個273bp的開放閱讀框，編碼90個氨基酸，包含24個氨基酸的信號肽和66個氨基酸的成熟肽。序列比較和進化樹分析表明，對蝦中已報道的含有WAP結(jié)構(gòu)域的肽/蛋白分成3類：crustinⅠ、Ⅱ和SWD。Fc-SWD是SWD亞族的新成員。 Northernblot分析表明Fc-SWD轉(zhuǎn)錄體在正常對蝦血細胞中組成型表達，在感染的對蝦血細胞中表達增加。但是在正常和感染對蝦的心臟、肝胰腺、胃、鰓、腸、卵巢中未檢測到表達。R

7、T-PCR結(jié)果表明在正常和刺激的對蝦血細胞、心臟、鰓中及感染對蝦的胃中有Fc-SWD的表達。原位雜交結(jié)果表明Fc-SWD在對蝦三種血細胞中均有表達，但是在其中的一類細胞中mRNA的表達信號最強；免疫組化結(jié)果也表明Fc-SWD蛋白在某一類細胞中有很強的表達信號；這些結(jié)果表明Fc-SWD在對蝦某一類血細胞高表達而不是所有細胞中表達。 Westernblot分析表明Fc-SWD在血細胞和血淋巴中均有信號檢出，且血細胞中的分子量大于血淋

8、巴中的分子量，說明Fc-SWD在血細胞中合成且含有信號肽，當病原菌感染時以成熟肽分泌到血淋巴中發(fā)揮作用。 成功構(gòu)建了Fc-SWD基因的三種原核表達載體：原核重組表達載體Fc-SWD，mFc-SWD和Fc-WAPD，并對三種蛋白進行了誘導表達和純化；利用牛津杯法和最小抑菌濃度的方法研究了純化后三種重組蛋白的抗菌活性；利用生物化學和酶學方法分析了純化后三種重組蛋白的抑制蛋白酶活性。結(jié)果表明重組蛋白Fc-SWD和mFc-SWD對革蘭氏

9、陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有抑制作用，并且對枯草蛋白酶A和蛋白酶K有較強的抑制作用，對胰蛋白酶的抑制作用較弱；Fc-SWPD幾乎沒有抑菌作用，但是有抑制蛋白酶的活性，對枯草蛋白酶A和蛋白酶K的抑制作用強于對胰蛋白酶的抑制作用。 這些研究結(jié)果表明Fc-SWD可能是對蝦抵抗各種病原菌的免疫系統(tǒng)中重要的效應因子之一。Fc-SWD具有抗菌作用和抑制蛋白酶作用，是一種具有雙重功能、具有廣泛的開發(fā)前景和藥用價值的生物活性肽。 二、

10、中國明對蝦Fc-GS的功能分析 谷氨酰胺合成酶是一個廣泛分布的酶，以3種不同的蛋白形式存在于所有生物體中：GSⅠ型家族，主要在原核生物中發(fā)現(xiàn)；GSⅡ型家族，主要存在于真核生物中和少數(shù)細菌中；GSⅢ型家族主要在原核生物中發(fā)現(xiàn)。 GS在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、細胞增殖與分化、胚胎發(fā)育、大分子合成、圍食膜基質(zhì)的形成等方面發(fā)揮著重要作用。 本試驗成功克隆到了中國明對蝦Fc-GS基因，其cDNA全長1376bp，含有一個108

11、6bp的開放閱讀框，編碼361個氨基酸。編碼蛋白的分子量約40.47kDa、等電點為6.32。同源性比較和進化樹分析表明中國明對蝦Fc-GS基因?qū)儆贕SⅡ家族。 利用RT-PCR方法對細菌或病毒感染對蝦的血細胞、心臟、肝胰腺、胃、鰓、腸和卵巢中Fc-GS的表達進行了分析；同時也對感染后不同時間段的肝胰腺、鰓和卵巢的表達情況進行了分析；結(jié)果表明病原菌感染的對蝦中，F(xiàn)c-GS的表達在基因水平上被高度調(diào)控。細菌和病毒感染對蝦的胃和腸中

12、的Fc-GSmRNA表達水平明顯增加；病毒感染對蝦血細胞、鰓和卵巢中Fc-GSmRNA水平顯著上調(diào)，細菌感染的鰓中Fc-GS表達量增加。 利用Westernblot方法對正常、弧菌刺激和對蝦白斑綜合征病毒刺激對蝦的肝胰腺、心臟、胃、腸、卵巢和肌肉組織中Fc-GS的蛋白質(zhì)表達水平進行了分析，結(jié)果表明在檢測的組織中均有表達，并且弧菌和WSSV刺激的胃、腸和卵巢中Fc-GS的表達明顯增加。細菌和病毒感染的鰓、胃、腸和肌肉中Fc-GS蛋

13、白也被誘導表達。 成功構(gòu)建了中國明對蝦Fc-GS的原核表達載體，得到了重組蛋白，并對重組蛋白和對蝦肌肉中Fc-GS進行了酶學分析。酶活性分析表明原核重組表達的重組中國明對蝦Fc-GS合成酶活性最佳pH是6.0-7.5，最佳溫度是37℃。細菌和病毒感染對蝦肌肉中Fc-GS的合成酶活性與正常對蝦的相比顯著增加。與正常對蝦相比，細菌或病毒感染的對蝦肌肉中Fc-GS的合成酶活性增加了2倍。 這些結(jié)果表明中國明對蝦Fc-GS可能在

14、抵抗病原微生物入侵，特別是病毒感染的免疫反應中起作用?；蚝偷鞍椎纳险{(diào)作用可以作為檢測對蝦被病毒感染雙重標準。 該基因的研究對了解中國明對蝦Fc-GS參與抗病毒免疫相關(guān)的作用機制提供了參考依據(jù)。為了解中國明對蝦被病原菌感染后的健康狀態(tài)提供了方法依據(jù)。 三、中國明對蝦Fc-Ras特性分析 原癌基因Ras是一種多功能的細胞因子，該基因編碼的蛋白是信號轉(zhuǎn)導的重要組織者，直接參與細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導途徑和影響其它細胞信號轉(zhuǎn)導途徑

15、。Ras蛋白是一種小GTP結(jié)合蛋白，對細胞外信息的跨膜傳遞起著重要作用，被稱為細胞信號網(wǎng)絡傳遞中的“分子開關(guān)”。 克隆到的中國明對蝦Fc-Ras基因cDNA全長為1013bp，含有561bp的開放閱讀框編碼186個氨基酸。編碼區(qū)含有3個EGF_1位點；1個2FE2S_FER_1位點；編碼蛋白的分子量約21kDa、等電點為6.37。 用RT-PCR的方法分析Fc-Ras在正常、弧菌或WSSV刺激的對蝦血細胞、心臟、肝胰腺、

16、胃、鰓、腸、卵巢或精巢的表達模式。與正常對蝦相比，弧菌刺激后的血細胞、肝胰腺、鰓、胃中Fc-RasmRNA的表達明顯增加；心臟、卵巢中的表達降低；刺激的腸中僅有微弱的增加。WSSV刺激對蝦的血細胞、心臟、鰓、胃、腸、卵巢、精巢中Fc-RasmRNA表達量明顯增加，肝胰腺中增加不明顯。用Westernblot方法分析了中國明對蝦Fc-Ras在不同組織中的表達變化：正常的胃、腸中沒有Fc-Ras蛋白的表達，但是菌刺、毒刺胃和腸中Fc-Ras

17、蛋白高表達；正常、菌刺、毒刺卵中均有Fc-Ras表達，且表達量增加。免疫組化的結(jié)果表明中國明對蝦血細胞中有Fc-Ras的表達但是并不是所有的細胞都有很強的表達，而某一類細胞整體有很強的表達信號。 WSSV刺激后的各組織中mRNA水平均有不同程度的增加，在檢測的各組織中Fc-Ras蛋白的表達也增加，這些研究結(jié)果表明Fc-Ras可能參與對蝦抗WSSV的免疫。對了解先天免疫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑在病原微生物入侵對蝦時所起的作用具有重要意義