龍須菜世代差異表達基因和泛素基因的克隆及功能分析.pdf

1、龍須菜已經成為我國繼海帶和紫菜后的第三大栽培海藻，不僅是江蘺屬的一個重要的產瓊膠物種，而且還是一種遺傳學研究的好材料。因此，對龍須菜進行基礎研究，具有重要意義。本論文構建了龍須菜四分孢子體和雌配子問正反向抑 制性消減雜交(SSH)文庫，分離了兩世代間差異表達的基因，并對其中若干基 因進行了功能研究。 本研究選取正反向SSH文庫中各384個克隆進行斑點雜交篩選，篩選出14個在兩世代間差異表達的基因，序列測定后提交到NCBI網站

2、上GenBank數據庫，序列登錄號為DQ008074-87。其中的7條序列分別與編碼小GTP結合蛋白(Small GTPase)即小G蛋白、天冬氨酸轉移酶、GMP合成酶、硫胺素焦磷酸化酶、R42蛋白和兩種未知功能蛋白有同源性，而其余7條序列沒有找到與其相匹配的基因。Virreal Northern雜交實驗進一步證實了14個基因中的11個在兩世代間呈現表達差異，其中7個是四分孢子體中上調表達的基因，3個在雌配子體中上調表達以及1個四分孢子

3、體特異表達的基因。 論文中選擇了SSH文庫中在雌配子體中上調表達的小G蛋白基因和一個在四分孢子體中特異表達的基因，進行cDNA全長序列的分離及功能分析。序列比對后發(fā)現，該龍須菜小G蛋白尤其與動物來源的Rabll有較高的同源性。在小G蛋白基因的RACE反應中，PCR擴增出兩種小G蛋白基因轉錄物。測序后將二者與其基因組序列比較后發(fā)現，其中一個是mRNA前體加工過程中的中間體，另一個是成熟的mRNA，前者只剪切掉了一個內含子，而在成熟

4、mRNA分子中 兩個內含子均被剪切掉了。Rab基因的兩種轉錄物序列及其在基因組上的序列均提交到NCBI網站，GenBank序列登錄號分別為DQ062156、AY904354和DQ019225。Southem雜交結果表明該基因在龍須菜基因組中可能是單拷貝的。我們還利用兩種原核表達載體(融合表達載體pGEX和非融合表達載體 DBV220)，在大腸桿菌中表達了龍須菜小G蛋白，對融合重組表達產物進行了抗原性及其抗血清的免疫特異性分析。結果表明該

5、重組蛋白具有很強的免疫原性和 免疫特異性。利用Western雜交技術對兩種表達產物進行體外GTP結合性分析，實驗結果表明這兩種重組蛋白均具有GTP結合活性。我們還從文庫中選取了一個四分孢子體特異表達基因(克隆SSH466)，分離了cDNA全長序列，GenBank 序列登錄號DQ019223。序列同源性分析表明，該基因是一個未知功能基因。蛋白模體分析表明陔基因編碼的多肽可能是一種內在膜蛋白。 另外，我們還克隆了龍須菜融合泛素基因

6、、多聚泛素基因及多聚泛素基因的上游調控序列，并進行了序列分析及兩基因在四分孢子體和雌配子體表達的初步研究。三條序列經測定后提交到NCBI網站上GenBank數據庫，序列登錄號分別為DQ019224、AY957885和DQ333344。泛素基因序列及其氨基酸序列的比對結果表明，龍須菜融合泛素的保守性較多聚泛素差，但二者的進化地位基本一致，紅藻多聚泛素基因內部存在一定程度的趨同進化。兩泛素基因在龍須菜雌配子體與四分孢子體中呈現出表達差異，融

7、合泛素基因在兩者的表達量相當，而多聚泛素基因在前者的表達量較后者低很多，與減數分裂有關的生命活動過程可能影響了多聚泛素基因的表達，使其表達呈現上調。多聚泛素基因上游調控序列分析結果表明該序列沒有內含子。啟動子預測結果表明在429-479bp處有一條可信度為1．OO的核心啟動子。轉錄調控因子分析結果表明該序列有多種轉錄調控因子，主要是一些與脅迫條件相關，或是在某個特定發(fā)育階段調控表達的元件，其余還有一些是植物特有的，如在光控基因等的調控序