龍須菜降解產(chǎn)物的活性研究及降解菌Flammeovirga pacifica中硫酸酯酶基因的克隆表達(dá).pdf

1、　　本文利用一株從太平洋深海沉積物篩選到的可直接降解龍須菜產(chǎn)生寡糖的菌株Flammeovirgapacifica進(jìn)行相關(guān)研究。從Flammeovirgapacifica的全基因組序列中,我們發(fā)現(xiàn)了80余個(gè)可能的硫酸酯酶基因。通過(guò)NCBI比對(duì),選取了同源性最高的芳香基硫酸酯酶基因Ary42 3進(jìn)行克隆表達(dá)。該基因含有1536個(gè)堿基,編碼511個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為57.2KD,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.9。SignalP 3.0 server軟件分

2、析該基因的前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。利用pET-His構(gòu)建了Ary423的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)其表達(dá),經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化,獲得了在非變性條件下純化的His融合蛋白。酶活檢測(cè)表明,具有降解PNPS的活性。并且可以降解龍須菜粗多糖,脫去粗多糖的硫酸根。該重組菌的最適溫度為40℃,最適pH為8-9。Mg2+離子對(duì)酶有較為明顯的激活作用,Fe3+,Cu2+能抑制酶的活力。巰基乙醇,尿素,10mmol/L的EDTA對(duì)其有

3、一定的抑制作用。
　　利用該菌株降解龍須菜直接產(chǎn)生的寡糖,我們分別從抑菌,促生長(zhǎng),抗氧化,以及保鮮等幾個(gè)方面做了應(yīng)用方面的研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),80ppm的寡糖發(fā)酵液能夠顯著地促進(jìn)小浮萍的生長(zhǎng),通過(guò)電子顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,培養(yǎng)基中加入寡糖的小浮萍?xì)饪鬃兇?組織細(xì)胞變大。在抑制微生物生長(zhǎng)方面,我們選取了常見的幾種真菌(黑曲霉,宛氏擬青霉,黃萎病菌,核盤菌)和細(xì)菌(大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,溶藻活菌,副溶血弧菌)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)

4、寡糖溶液能夠顯著抑制核盤菌的生長(zhǎng),1.6mg/mL的寡糖溶液的抑菌率可以達(dá)到50%。但對(duì)其他真菌和所有的細(xì)菌均沒(méi)有抑制作用。具體的抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。在抗氧化活性方面,我們分別以果蠅對(duì)百草枯的抗性,鄰苯三酚自氧化,清除DPPH自由基為模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),寡糖能顯著的提高雌性果蠅的壽命,減緩鄰苯三酚的自氧化速率,有效地清除DPPH自由基。在草莓保鮮方面,寡糖可以具有減少水分流失的以及減少貯藏草莓Vc損失的作用。
　　我們對(duì)寡