氰氟草酯降解菌分離鑒定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因(chbH)的克隆和表達(dá).pdf

1、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化和分解等環(huán)境行為及其對(duì)人類健康的潛在危害正日益受到關(guān)注，分離篩選能降解氰氟草酯的微生物并研究其降解機(jī)制具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　 本文通過對(duì)長(zhǎng)期受芳氧苯氧丙酸類除草劑污染的稻田土壤中進(jìn)行富集篩選，分離到五株能降解氰氟草酯菌株，分別命名為QDZ-1，QDZ-A，QDZ-B，QDZ-C，QDZ-D.經(jīng)過形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S

2、rRNA基因序列分析，分別鑒定其屬 Pseudomonas sp。(QDZ-1)，Agromyces sp.(QDZ-A)，Stenotrophomonas sp.(QDZ-B)，Aquamicrobium sp。(QDZ-C)，Microbacterium sp.(QDZ-D)。經(jīng)過對(duì)降解效果進(jìn)行比較，選擇一株較高效氰氟草酯降解菌QDZ-1為研究對(duì)象，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　 菌株QDZ-1無芽孢、革蘭氏陰性、短桿狀、

3、一端生多根鞭毛。在LB固體平板培養(yǎng)兩天后，菌落圓形、邊緣光滑、呈黃色。能在15℃-37℃生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25℃-30℃，菌株ODZ-1在pH5.5-10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，當(dāng)pH低于5.5菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制，最適pH值為7.0，好氧性生長(zhǎng)，QDZ-1的最適生長(zhǎng)NaCl濃度是0.5％，當(dāng)NaCl濃度小于2.5％時(shí)，菌體生長(zhǎng)良好，當(dāng)NaCl濃度大于3.5％時(shí)，生長(zhǎng)受到明顯的抑制。
　　 菌株QDZ-1能夠以氰氟草酯為唯一碳源

4、進(jìn)行生長(zhǎng)，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，降解率達(dá)到84.5％。菌株QDZ-1降解氰氟草酯的最適溫度為30℃，最適pH為7.0。QDZ-1同樣也能降解其他芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，5 d能降解68.9％的禾草靈，64.6％的精吡氟氯禾靈，92.6％的精喹禾靈，90.8％的精惡唑禾草靈和79.6％的精吡氟禾草靈。菌株和菌株的粗酶液能夠在有農(nóng)藥(150 mg/L)的平板上產(chǎn)生水解圈。通過質(zhì)譜機(jī)檢測(cè)到QDZ-1以氰氟草酯為唯一碳源的液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中代謝此農(nóng)

5、藥時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。在對(duì)代謝物結(jié)構(gòu)的分析基礎(chǔ)上推測(cè)了QDZ-1降解氰氟草酯的代謝途徑。結(jié)果表明QDZ-1在降解氰氟草酯時(shí)，首先斷裂其結(jié)構(gòu)核心-酯鍵生成氰氟草酸，其次醚鍵斷裂脫羧，最后氰基酰胺化。
　　 通過構(gòu)建基因組DNA文庫，以氰氟草酯水解為氰氟草酸產(chǎn)生的透明水解圈作為氰氟草酯水解酶活力篩選標(biāo)記，成功從菌株P(guān)seudomonas sp.QDZ-1中克隆到一個(gè)新的氰氟草酯水解酶基因，命名為chbH。通過Omiga軟件分析chbH

6、具有996堿基得到編碼332個(gè)氨基酸，分子量為36 KDa。ChbH推測(cè)的氨基酸序列在NCBI的蛋白序列數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，結(jié)果表示chbH編碼蛋白屬于酯(脂肪)酶超家族。chbH編碼蛋白與一些假設(shè)或推測(cè)性水解酶相似性最高；與Pseudomonas fluorescens的酯酶，82％的同源性；與Ralstonia eutropha H16的水解酶，50％的同源性；Burkholderia multivorans ATCC17616的α/β-

7、水解酶，48％的同源性。以pET29a為表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET29a-chbH，實(shí)現(xiàn)了ChbH蛋白在E.coli BL21(DE3)中的融合表達(dá)，并用鎳離子親和層析柱純化融合蛋白ChbH。ChbH能水解多種芳氧苯氧丙酸酯類除草劑如精喹禾靈、精惡唑禾草靈、氰氟草酯、禾草靈和精吡氟氯禾靈。水解速率順序?yàn)椋壕天`≈精惡唑禾草靈>氰氟草酯>禾草靈≈精吡氟氯禾靈。醇鏈長(zhǎng)度嚴(yán)重影響芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的生物降解，對(duì)具有相同的醇鏈長(zhǎng)度的不同