降解鄰苯二甲酸二乙酯低溫鹽堿菌的篩選及降解酯酶基因的克隆.pdf

1、鄰苯二甲酸酯(Phthalateesters，簡(jiǎn)稱PAEs)是一類廣泛使用的化合物，主要用于聚氯乙烯樹脂的合成、粘膠劑、塑料薄膜的生產(chǎn)。近年來(lái)，由于PAEs的大量使用，這類化合物廣泛存在于水體、大氣、土壤等環(huán)境中，對(duì)人類健康、其它生物和環(huán)境的危害引起了人們的普遍關(guān)注。PAEs危害人體和野生動(dòng)物正常激素的分泌，導(dǎo)致內(nèi)分泌功能紊亂、生長(zhǎng)發(fā)育異常、出生缺陷和腫瘤發(fā)生率增加、生殖能力下降等危害，被列入內(nèi)分泌干擾物質(zhì)。因此，如何有效控制和消除環(huán)境

2、內(nèi)PAEs引起的污染己成為當(dāng)務(wù)之急。 本論文從油田廢坑樣品中分離得到6株能以環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)鄰苯二甲酸二乙酯為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，選取其中降解鄰苯二甲酸二乙酯效率最高的菌株L6為研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)降解菌株L6的形態(tài)、生理生化特性和16SrDNA分子鑒定，發(fā)菌株L6的16SrDNA序列與NCBI中Halomonassp.的有很高的同源性，其中與菌株Halomonassp.IB-559有99％的同源性。因此，將菌株L6的初步鑒定為H

3、alomonassp.屬，命名為Halomonassp.L6。在溫度為4℃-35℃，NaCl濃度為0％-25％，pH為6-12的范圍內(nèi)該菌株均能生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適鹽濃度為5％，最適pH為9.0。根據(jù)極端環(huán)境微生物的分類，菌株L6屬于耐冷的中度嗜鹽嗜堿菌。除此之外，還研究了碳源、氮源、金屬離子、通氣量等其它外界條件對(duì)菌株Halomonassp.L6生長(zhǎng)的影響。菌株Halomonassp.L6產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二乙酯的降解酯酶

4、為胞內(nèi)酶。通過(guò)對(duì)粗酶液的酶活性及耐受性的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)最適pH為9.0，最適NaCl濃度為4％，與該菌生長(zhǎng)的最適溫度、pH均一致。 本論文以pUCl8為載體成功構(gòu)建了菌株Halomonassp.L6的基因組DNA文庫(kù)。利用酯酶水解X-caprylate產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物的特點(diǎn)，高效篩選到包含目的酯酶基因的陽(yáng)性克隆子5B-68。該克隆子經(jīng)酶切和測(cè)序分析，插入約6kb的外源片段，BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：該片段

5、中包含多個(gè)ORF，其中一個(gè)ORF長(zhǎng)度為432bp，編碼143個(gè)氨基酸殘基的蛋白，該蛋白與NCBI中登錄的PaaIthioesterase有93.8％的同源性。此外，通過(guò)降解實(shí)驗(yàn)表明，該序列表達(dá)蛋白能降解鄰苯二甲酸二乙酯。因此，我們可以確定該酶為目的酯酶。 鑒于本論文篩選的降解菌L6具有較廣泛的生長(zhǎng)溫度、鹽濃度、pH、底物降解譜以及對(duì)多種金屬離子都有比較強(qiáng)的耐受性。因此該菌株的開發(fā)利用可以用來(lái)解決因PAEs有機(jī)物引起的環(huán)境污染問(wèn)題