鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)基因和蛋白研究.pdf

1、我室前期從長江和嘉陵江水中檢出178種有機污染物，其中鄰苯二甲酸酯(PhthalicAcidEsters，PAEs)是主要污染物，濃度達到22.8μg/L；同時，PAEs也是重慶市主城區(qū)人群體內(nèi)的主要污染物，濃度達到78.29μg/L。我們針對PAEs的生物降解開展了相關(guān)研究。從污染環(huán)境中分離了多株P(guān)AEs降解菌，均能以PAEs為唯一碳源和能源進行生長，其中降解菌CQ0110Y的降解效率最高。本實驗圍繞降解菌CQ0110Y的基本性狀、降

2、解相關(guān)基因和降解相關(guān)蛋白三部分內(nèi)容展開研究，為CQ0110Y的環(huán)境污染治理應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。 一、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y基本性狀 1.根據(jù)伯杰氏細(xì)菌分類手冊第八版和第九版中描述的模式菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特征，結(jié)合16SrRNA在genbank中的比對結(jié)果，菌株CQ0110Y屬于微桿菌屬(Microbacteriumsp.)。這是國際上首次報道的具有PAEs降解性能的微桿菌屬細(xì)菌。 2.CQ0110Y

3、進行生物降解反應(yīng)的最佳pH為6.0～8.0；最佳溫度為20～35℃。 3.當(dāng)DEHP初始濃度低于1350mg/L時，CQ0110Y對不同初始濃度DEHP的降解反應(yīng)符合同一指數(shù)動力學(xué)模型，動力學(xué)方程：InC=-0.4087t+A；半減期t1/2=1.59d。 4.CQ0110Y對DEHP的降解性能優(yōu)于其它幾種PAEs，對其它PAEs的降解性能隨著PAEs側(cè)鏈碳原子的增加而下降。 5.推測DEHP在CQ0110Y菌作

4、用下可能的生物降解途徑為：鄰苯二甲酸酯在酯酶作用水解成單酯，繼續(xù)水解成鄰苯二甲酸，進一步降解成苯甲酸，苯甲酸在加氧酶作用下形成鄰羥基苯甲酸，鄰羥基苯甲酸脫羧基生成苯酚，進一步生成鄰苯二酚，在1，2-雙加氧酶作用下生成己二烯二酸，進一步生成丙酮酸、琥珀酸等進入三羧酸循環(huán)，最終轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水。 二、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)基因研究 1.通過限制性內(nèi)切酶SAu3AI隨機酶切細(xì)菌基因組DNA，回收3-10kb

5、范圍的DNA片段，采用stratagene公司的基因組文庫構(gòu)建試劑盒(載體為ZAPExpressVector和pBK-CMVVector，宿主菌是xLl-B1ueMRF’strain和XLOLRstrain，噬菌體包裝試劑為GigapackⅢGoldpackagingextract)，構(gòu)建了降解菌CQ0110Y的基因組文庫。經(jīng)效價測定，該文庫效價達到5x107PFU/μg連接DNA，文庫質(zhì)量高。 2.采用鄰苯二甲酸酯瓊脂平板特異

6、性選擇篩選法獲得150個陽性克隆，陽性克隆獲得率為1.2x10-4。經(jīng)過輔助噬菌體作用的單克隆切除，卡那霉素平板及PAEs無機鹽培養(yǎng)基雙重篩選，最終獲得一株陽性克隆菌株。 3.根據(jù)載體已知序列設(shè)計PCR引物，以重組體質(zhì)粒為模板，對目的DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后測序，將DNA序列在GenBank中進行登記，取得登記號為EF449771；采用ORFFinder對目的DNA進行分析發(fā)現(xiàn)，目的DNA中含有2895bp的ORF

7、，命名為phtY；經(jīng)過在Genbank數(shù)據(jù)庫的blast檢索比對，phtY與phosphoenolpyruvateCarboxylase(磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶)的編碼基因高度同源，同源性達到99％。 4.根據(jù)目的DNA已知序列設(shè)計PCR引物，以CQ0110Y基因組為模板進行PCR擴增，得到1700bp的DNA片段，與引物設(shè)計的DNA大小一致，驗證了本實驗獲得的phtY基因來源菌株CQ0110Y；同時，提取CQ0110Y總RNA，

8、經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行RT-PCR，也得到1700bp的DNA片段，說明phtY基因不但來源于菌株CQ0110Y并且能夠在細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA，可以編碼相應(yīng)的功能蛋白。 5.根據(jù)報道的PAEs降解菌DBF63的已知降解相關(guān)基因phtC設(shè)計相應(yīng)的引物，以本實驗的PAEs降解菌CQ0110Y的基因組為模板，通過PCR擴增相應(yīng)的功能基因。獲得700bp的DNA片段，經(jīng)與T載體連接后測序，序列分析顯示含有450bp的ORF，blast

9、檢索比對顯示為一功能未知的基因，但與phtC基因無同源性，原因不清楚。 三、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)蛋白研究 1.制備CQ0110Y菌分別在LB培養(yǎng)基和PAEs無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)生長的菌體總蛋白，分別代表CQ0110Y在PAEs誘導(dǎo)前后的總蛋白。采用二維凝膠電泳分離總蛋白，通過軟件分析，誘導(dǎo)前總蛋點有846個，誘導(dǎo)后總蛋白點有847個，誘導(dǎo)后新增加7個蛋白點，消失6個蛋白點，3倍以上表達上調(diào)有11個蛋白點，3

10、倍以上表達下調(diào)有9個蛋白點，2倍到3倍表達上調(diào)有33個蛋白點，2倍到3倍表達下調(diào)有38個蛋白點，總共有2倍以上表達差異的蛋白點104個。 2.分別對誘導(dǎo)后2倍以上表達差異的104個蛋白點進行了質(zhì)譜分析，經(jīng)過MSCOT搜索引擎檢索對差異表達蛋白質(zhì)進行了鑒定。根據(jù)這些功能蛋白的表達情況分析，PAEs降解菌CQ0110Y菌處在PAEs無機鹽培養(yǎng)基這個比較特殊的環(huán)境中，主要發(fā)生了四方面的改變。 (1)為應(yīng)對PAEs類物質(zhì)的細(xì)胞毒

11、性，細(xì)菌增強了對外環(huán)境的抗應(yīng)激及修復(fù)能力，增加了觸發(fā)因子和應(yīng)急蛋白ClpB等分子伴侶、核糖體蛋白、轉(zhuǎn)肽酶以及核甙酸基轉(zhuǎn)移酶的表達量。 (2)為應(yīng)對所處的貧營養(yǎng)環(huán)境，增強從外界攝取物質(zhì)及能量的能力，增加了甲酰四氫葉酸酯合成酶、帶7蛋白、多糖轉(zhuǎn)運外膜蛋白及外膜孔道蛋白OmpF的表達量。 (3)增強了利用培養(yǎng)基內(nèi)作為唯一碳源和能源的PAEs的能力，水解酶、加氧酶、脫羧酶等降解功能相關(guān)的蛋白酶的表達量由此得到增加。 (4

12、)與LB培養(yǎng)基相比，細(xì)菌在PAEs無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)生長變緩，許多與生長代謝相關(guān)的蛋白酶的表達下調(diào)，包括DNA解螺旋酶、RNA聚合酶、DNA錯配修復(fù)蛋白、組氨酸激酶、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶等。 3.本研究結(jié)果提示很有必要對這些功能蛋白酶(如MEHP水解酶、加氧酶、雙加氧酶、脫羧酶等)繼續(xù)進行深入研究。 總之，本研究基于從污染環(huán)境分離的PAEs降解菌CQ0110Y進行了系列研究，該菌能夠利用PA

13、Es作為唯一碳源和能源進行生長，具有高效降解性能，初步闡明了生物降解機理。通過構(gòu)建并篩選基因組文庫獲得了PAEs降解相關(guān)基因phtY；通過蛋白質(zhì)譜差異表達蛋白觀察到了PAEs降解相關(guān)蛋白(MEHP水解酶、加氧酶、雙加氧酶、脫羧酶等)并分析了降解菌CQ0110Y在PAEs無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)生的系列變化。該研究與國內(nèi)外其它相關(guān)報道比較，發(fā)現(xiàn)降解菌為應(yīng)對貧營養(yǎng)環(huán)境而發(fā)生了系列變化，這是以前未見報道的。今后應(yīng)進一步開展MEHP水解酶、加氧酶、雙加