截形苜蓿（Medicago truncatula）鹽誘導(dǎo)差異表達(dá)基因的克隆及功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化分布范圍廣，整治改造困難，對農(nóng)作物推廣種植和生產(chǎn)構(gòu)成重大阻礙。因此改良農(nóng)作物的鹽耐受能力，利用鹽漬化土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的問題。研究表明植物的抗鹽性狀是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀，這決定了抗鹽機(jī)制的復(fù)雜性。雖然進(jìn)行了廣泛的研究探討，但目前人們對控制植物抗鹽起作用的關(guān)鍵相關(guān)基因及其分子機(jī)制等還不很清楚，這就嚴(yán)重阻礙了人們通過遺傳選擇或轉(zhuǎn)基因技術(shù)等途徑來顯著提高植物整體的抗鹽能力。本研究旨在通過分離和克隆與截形苜蓿鹽誘導(dǎo)表達(dá)相

2、關(guān)基因的探索性研究，初步揭示參與苜?？果}相關(guān)基因的種類和數(shù)量，為進(jìn)一步深入開展植物抗鹽的分子機(jī)理研究及將來通過遺傳轉(zhuǎn)化選擇提高苜?？果}性提供理論基礎(chǔ)。本研究取得的主要結(jié)果如下： 1.應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了苜蓿鹽脅迫誘導(dǎo)下生長與正常生長的差異表達(dá)cDNA文庫。以美國農(nóng)業(yè)部提供的澳大利亞產(chǎn)的截形苜蓿（Medicago truncatula,australia）為材料，分離Poly(A)+ RNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈及

3、雙鏈cDNA，經(jīng)酶切成為平均大小400~600bp的片段。將鹽脅迫誘導(dǎo)的cDNA分成兩組，分別與2種不同的接頭連接，再與正常生長的cDNA進(jìn)行2次消減雜交和2次抑制性PCR擴(kuò)增，將第2次PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行文庫擴(kuò)增，最終構(gòu)建得到了具有高消減效率的截形苜蓿鹽脅迫抗性相關(guān)正向cDNA文庫。文庫擴(kuò)增后得到超過500個(gè)白色陽性克隆，隨機(jī)挑選29個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明插入片段主

4、要分布在250~750bp 之間。 2.應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)從消減cDNA文庫中隨機(jī)提取318個(gè)白斑，高通量篩選得到173個(gè)差異表達(dá)的克隆。分別用地高辛標(biāo)記鹽脅迫誘導(dǎo)截形苜蓿和正常生長截形苜蓿cDNA作為雜交探針，對構(gòu)建的cDNA消減文庫利用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)篩選出173個(gè)差異表達(dá)克隆，隨機(jī)挑選50個(gè)測序后得到49個(gè)質(zhì)量合格的EST序列。根據(jù)在GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(nr)和EST數(shù)據(jù)庫中B