CPPU誘導(dǎo)的小麥差異表達(dá)蛋白分析及編碼基因的克隆.pdf

1、CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，英文通用名：forchlorfenuron)是一種人工合成的吡啶取代脲類細(xì)胞分裂素，它的生理活性超過了玉米素。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CPPU處理小麥能促使小麥分蘗。而分蘗是影響小麥等主要農(nóng)作物穗數(shù)多少并進(jìn)而影響單產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一。本研究通過蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，研究CPPU處理引起的小麥差異表達(dá)譜，找到與生長素和細(xì)胞分裂素合成有關(guān)的兩個(gè)蛋白。采用生物信

2、息學(xué)分析、基因克隆、熒光定量RT-PCR分析、載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化等方法，克隆獲得了小麥TatRNAIPT和TaYUCCA兩個(gè)新的基因并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)特性分析，對(duì)TaYUCCA的功能做了初步研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.CPPU對(duì)小麥分蘗的影響。室內(nèi)試驗(yàn)表明，CPPU處理可誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生分蘗，CPPU誘導(dǎo)小麥發(fā)生分蘗的較適宜濃度為6μmol/L。大田中小麥成熟后統(tǒng)計(jì)不同CPPU濃度處理的單株有效分蘗數(shù)表明，小麥單株有效分蘗數(shù)隨

3、處理濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，用6μmol/LCPPU處理的小麥單株有效分蘗數(shù)最多。
　　 2.CPPU誘導(dǎo)小麥差異表達(dá)蛋白分析。與對(duì)照相比，CPPU處理后發(fā)現(xiàn)有10個(gè)差異蛋白點(diǎn)表達(dá)量顯著上調(diào)，將這10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF分析，獲得其肽質(zhì)量指紋圖譜，根據(jù)肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)，在Mascot網(wǎng)站進(jìn)行檢索，得出這10個(gè)蛋白點(diǎn)分別是tRNA的二甲基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白y4tS、核糖體RNA大亞基甲

4、基轉(zhuǎn)移酶、微管結(jié)合蛋白6、激動(dòng)蛋白-66、線粒體ATP合酶α亞基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1、黃素單加氧酶YUCCA4、GTPaseobg和核糖體RNA小亞基甲基轉(zhuǎn)移酶G。這些蛋白質(zhì)與植物激素合成、植物脅迫反應(yīng)、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞骨架建構(gòu)和運(yùn)輸有關(guān)。
　　 3.克隆到小麥TatRNAIPT和TaYUCCA基因并進(jìn)行序列分析。從小麥中克隆獲得TatRNAIPT和TaYUCCA兩個(gè)基因，TatRNAIPT基因編碼466個(gè)氨基酸

5、殘基，TaYUCCA基因編碼382個(gè)氨基酸殘基。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)TatRNAIPT和TaYUCCA進(jìn)行分析，信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示這兩個(gè)基因編碼蛋白均不含有信號(hào)肽，可能在細(xì)胞質(zhì)中行使功能。BLAST序列比對(duì)顯示TatRNAIPT氨基酸序列含特征功能域：P-loopNTPase超家族，TaYUCCA氨基酸序列含特征功能域：Pyrredox超家族。聚類分析表明TatRNAIPT與已報(bào)道的水稻OstRNAIP工具有較高相似性，TaYUCCA與短柄

6、草BdYUCCA具有較高的相似性。
　　 4.TaYUCCA基因的表達(dá)分析。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析表明，與水對(duì)照相比，6μmol/LCPPU處理24h、48h后TaYUCCA基因均上調(diào)表達(dá)，其中處理48h后TaYUCCA基因表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)的幅度較大。將萌發(fā)的小麥種子的四個(gè)部分做半定量RT-PCR，結(jié)果表明與芽尖和芽中間部位相比，分蘗部位和根部TaYUCCA基因的表達(dá)量較高。
　　 5.構(gòu)建了TaYUCCA植物表達(dá)載

7、體并初步分析了基因的功能。通過農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)TaYUCCA擬南芥植株。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥出芽較野生型晚，下胚軸明顯伸長且葉子卷曲。
　　 本研究利用蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)分析了CPPU處理小麥引起的差異表達(dá)蛋白，并首次克隆到與生長素和細(xì)胞分裂素合成相關(guān)的兩個(gè)基因TaYUCCA和TatRNAIPT的全長序列，分析了序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基因表達(dá)特性，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，并對(duì)轉(zhuǎn)TaYUCCA擬南芥的生長性狀進(jìn)行