CPPU誘導的小麥差異表達蛋白分析及編碼基因的克隆.pdf

1、CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，英文通用名：forchlorfenuron)是一種人工合成的吡啶取代脲類細胞分裂素，它的生理活性超過了玉米素。前期試驗發(fā)現(xiàn)，用CPPU處理小麥能促使小麥分蘗。而分蘗是影響小麥等主要農作物穗數(shù)多少并進而影響單產的重要農藝性狀之一。本研究通過蛋白質雙向電泳和質譜技術，研究CPPU處理引起的小麥差異表達譜，找到與生長素和細胞分裂素合成有關的兩個蛋白。采用生物信

2、息學分析、基因克隆、熒光定量RT-PCR分析、載體構建及遺傳轉化等方法，克隆獲得了小麥TatRNAIPT和TaYUCCA兩個新的基因并對其進行了表達特性分析，對TaYUCCA的功能做了初步研究，主要研究結果如下：
　　 1.CPPU對小麥分蘗的影響。室內試驗表明，CPPU處理可誘導小麥產生分蘗，CPPU誘導小麥發(fā)生分蘗的較適宜濃度為6μmol/L。大田中小麥成熟后統(tǒng)計不同CPPU濃度處理的單株有效分蘗數(shù)表明，小麥單株有效分蘗數(shù)隨

3、處理濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，用6μmol/LCPPU處理的小麥單株有效分蘗數(shù)最多。
　　 2.CPPU誘導小麥差異表達蛋白分析。與對照相比，CPPU處理后發(fā)現(xiàn)有10個差異蛋白點表達量顯著上調，將這10個蛋白質點進行MALDI-TOF-TOF分析，獲得其肽質量指紋圖譜，根據(jù)肽質量指紋圖譜數(shù)據(jù)，在Mascot網站進行檢索，得出這10個蛋白點分別是tRNA的二甲基轉移酶、ABC轉運ATP結合蛋白y4tS、核糖體RNA大亞基甲

4、基轉移酶、微管結合蛋白6、激動蛋白-66、線粒體ATP合酶α亞基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1、黃素單加氧酶YUCCA4、GTPaseobg和核糖體RNA小亞基甲基轉移酶G。這些蛋白質與植物激素合成、植物脅迫反應、能量代謝、蛋白質合成、細胞骨架建構和運輸有關。
　　 3.克隆到小麥TatRNAIPT和TaYUCCA基因并進行序列分析。從小麥中克隆獲得TatRNAIPT和TaYUCCA兩個基因，TatRNAIPT基因編碼466個氨基酸

5、殘基，TaYUCCA基因編碼382個氨基酸殘基。利用生物信息學軟件對TatRNAIPT和TaYUCCA進行分析，信號肽預測顯示這兩個基因編碼蛋白均不含有信號肽，可能在細胞質中行使功能。BLAST序列比對顯示TatRNAIPT氨基酸序列含特征功能域：P-loopNTPase超家族，TaYUCCA氨基酸序列含特征功能域：Pyrredox超家族。聚類分析表明TatRNAIPT與已報道的水稻OstRNAIP工具有較高相似性，TaYUCCA與短柄

6、草BdYUCCA具有較高的相似性。
　　 4.TaYUCCA基因的表達分析。實時熒光定量RT-PCR分析表明，與水對照相比，6μmol/LCPPU處理24h、48h后TaYUCCA基因均上調表達，其中處理48h后TaYUCCA基因表達被誘導上調的幅度較大。將萌發(fā)的小麥種子的四個部分做半定量RT-PCR，結果表明與芽尖和芽中間部位相比，分蘗部位和根部TaYUCCA基因的表達量較高。
　　 5.構建了TaYUCCA植物表達載

7、體并初步分析了基因的功能。通過農桿菌浸花法轉化擬南芥，獲得轉TaYUCCA擬南芥植株。與野生型相比，轉基因擬南芥出芽較野生型晚，下胚軸明顯伸長且葉子卷曲。
　　 本研究利用蛋白質雙向電泳和質譜分析技術分析了CPPU處理小麥引起的差異表達蛋白，并首次克隆到與生長素和細胞分裂素合成相關的兩個基因TaYUCCA和TatRNAIPT的全長序列，分析了序列結構特點和基因表達特性，構建了植物表達載體，并對轉TaYUCCA擬南芥的生長性狀進行