ω-醇溶蛋白基因的克隆及通過RNAi抑制小麥α-醇溶蛋白基因家族表達研究.pdf

1、小麥醇溶蛋白主要賦予面粉的粘性。目前，已從普通小麥（Triticum aestivum）中克隆了大量的α-、γ-醇溶蛋白基因，但是已克隆的ω-醇溶蛋白基因數(shù)量還很少。根據(jù)小麥屬ω-醇溶蛋白基因設計了一對簡并引物，以體細胞雜種漸滲系Ⅱ-12及其親本小麥Jinan177和十倍體長穗偃麥草的gDNA為模板，擴增得到了16個ω-醇溶蛋白基因序列，長度變化為924～1146bp。其中，6個序列中因為含有編碼框內提前終止密碼子，因此可能是假基因。這

2、些序列與已知的ω-醇溶蛋白基因序列有高度的相似性。通過分析ω-醇溶蛋白基因推導的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)ω-醇溶蛋白由兩側短的N-端與C-端保守區(qū)及中間長重復可變區(qū)組成。系統(tǒng)進化分析表明這些ω-醇溶蛋白基因聚為三個亞家族：第一個包括來源于5個長穗偃麥草和1個Ⅱ-12的序列，表明至少有一個長穗偃麥草ω-醇溶蛋白基因通過體細胞雜交滲入Ⅱ-12中；第二個包括3個來自Ⅱ-12和6個來自于Jinan177的序列，它們都屬于ARQ/E型ω-醇溶蛋白基因；第三

3、個由三個來自于普通小麥的SRL型ω-醇溶蛋白基因組成。我們還發(fā)現(xiàn)，來自于第二亞家族的Ⅱ-12的一個ω-醇溶蛋白基因在其C端有一個Cys位點，這可能使其與面粉品質相關。所以我們預測，通過體細胞漸滲的方式使得雜種Ⅱ-12產生了新的ω-醇溶蛋白基因。
　　 乳糜瀉(coeliac disease)是患者進食麥類食品后，對其中的醇溶谷蛋白不耐受而引起的慢性小腸吸收不良綜合癥，而α-醇溶蛋白含有大量可導致乳糜瀉疾病的毒性肽段。本論文通過對

4、已發(fā)布的α-醇溶蛋白基因進行聚類，找出它們保守性較強的片段，根據(jù)本實驗室得到的一個來自于體細胞雜種漸滲系Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因設計引物，經PCR擴增得到保守性片段作為干擾α-醇溶蛋白基因家族的出發(fā)序列，并構建了RNA干擾真核表達載體p3301-Ubi-AR12與p3301-Ubi-AR34。通過農桿菌介導的轉化方法，分別將上述兩個載體轉化小麥株系，經PCR篩選后，初步得到了30株陽性株系。利用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳分別對這三十株陽性