α-醇溶蛋白與小麥育種.pdf

1、為了研究α-醇溶蛋白基因組成及其與小麥育種的關(guān)系，我們利用基因組PCR技術(shù)分離了158個(gè)α-醇溶蛋白基因的編碼序列。其中，從二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(diploid Agropyron elongatum)和老芒麥(Elymus sibiricus)中獲得63個(gè)α-醇溶蛋白基因的開放閱讀框(ORFs)，這些序列中90％存在內(nèi)部終止密碼子或移碼，前者主要是由于編碼谷氨酰胺的密碼子(CAG或CAA)發(fā)生了堿基C到T的顛換變?yōu)榻K止密碼子(TAG或TA

2、A)。通過(guò)分析α-醇溶蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白是由N-端信號(hào)肽，N-端重復(fù)區(qū)，第一個(gè)多聚谷氨酰胺區(qū)，N-端非重復(fù)區(qū)，第二個(gè)多聚谷氨酰胺區(qū)和C-端非重復(fù)區(qū)六部分組成，其中除了兩個(gè)變異較大的多聚谷氨酰胺區(qū)外，其他區(qū)域比較保守且序列間相似性較大；其差異主要?dú)w因于單核苷酸多態(tài)性(SNPS)、序列中的密碼子的改變或移碼突變。在重復(fù)區(qū)的前三個(gè)密碼子中，我們發(fā)現(xiàn)了一些新的基序，例如GRV和RV;在第一個(gè)多聚谷氨酰胺區(qū)出現(xiàn)了(Q)3AR

3、(Q)5，(Q)2AR(Q)5和(Q)3A新基序；我們也發(fā)現(xiàn)一些具有奇數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基的α-溶蛋白，并且非保守的半胱氨酸殘基在N-和C-末端非重復(fù)區(qū)都存在。在二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的假基因中發(fā)現(xiàn)了一種已知的乳糜瀉疾病(CD)抗原決定簇；在老芒麥的真基因中發(fā)現(xiàn)了兩種CD抗原決定簇。系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析表明，來(lái)自于二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的α-醇溶蛋白基因由若干個(gè)亞家族組成，與十倍體來(lái)源的基因聚在一起；而來(lái)自于老芒麥的a-醇溶蛋白基因則與小麥屬的α-醇溶蛋白

4、基因彼此之間具有更高的序列相似性。 同時(shí)，我們從小麥體細(xì)胞雜種漸滲系Ⅱ-12及其親本普通小麥JN177和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草中分離了95個(gè)α-醇溶蛋白基因的ORFs。序列比對(duì)的結(jié)果表明雜種Ⅱ-12中α-醇溶蛋白基因的組成和來(lái)源如下：(1)雜種中大多數(shù)α-醇溶蛋白基因和JN177α-醇溶蛋白基因相似；(2)小部分來(lái)自于十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的漸滲：(3)一些新的基因是由點(diǎn)突變、不等交換或者親本基因的復(fù)制滑動(dòng)所造成的。因此，我們證實(shí)了新的α-

5、醇溶蛋白基因可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而更快的產(chǎn)生，這種產(chǎn)生的方式與HMW-GS自然進(jìn)化的機(jī)制是一致的。進(jìn)一步氨基酸序列分析表明，在親本小麥JN177和Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因中鑒定出了四種已知類型的CD抗原決定簇，在十倍體長(zhǎng)穗偃麥草中只發(fā)現(xiàn)一種。值得注意的是雖然有相同的四種類型的CD表面抗原決定簇，但是雜種Ⅱ-12中編碼CD表面抗原決定簇序列的基因數(shù)量要低于JN177，特別是在假基因中則更低。文章討論了體細(xì)胞雜種α-醇溶蛋白與小麥育種的關(guān)系

6、。α-醇溶蛋白中半胱氨酸的數(shù)目和位置影響面粉的品質(zhì)，因此，我們選擇了兩個(gè)與面粉品質(zhì)具有潛在相關(guān)性的基因，一個(gè)來(lái)自于老芒麥，另一個(gè)來(lái)自于Ⅱ-12，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，然后構(gòu)建了基于ubiquitin啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pCAMBLA3301-E42和pcAMBLA3301-Ⅱ-93，接著運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)化小麥株系，通過(guò)雙引物PCR篩選后，初步獲得了19株陽(yáng)性株系，為進(jìn)一步的分子鑒定、遺傳分析、功能鑒定和育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。