番茄SlWHY2基因的克隆、表達和功能分析.pdf

1、植物在整個生長過程中，不可避免的會受到來自外界環(huán)境因子的各種刺激，如干旱、鹽漬和低溫等非生物脅迫及病蟲侵害等。植物自身在長期的進化過程中形成了抵抗各種生物脅迫和非生物脅迫的防御機制。干旱脅迫作為我國北方地區(qū)常見的非生物脅迫，影響番茄的生長發(fā)育，表現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和生化方面的變化，最終造成減產(chǎn)。此外，病蟲侵害也是影響番茄正常生長發(fā)育的因素之一。WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，可以通過響應(yīng)干旱及病害的刺激，調(diào)控編碼不同

2、抗氧化酶基因的表達來調(diào)控酶活性，調(diào)控脅迫相關(guān)基因及抗病相關(guān)基因的表達來增強植物的抗旱性和抗病性。
　　在本試驗中克隆得到番茄WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子SlWHY2基因，以轉(zhuǎn)基因煙草作為試驗材料，研究了SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下對活性氧的清除能力及其在抗病等方面的影響。本試驗主要結(jié)果如下：
　?。?）據(jù)NCBI得到該轉(zhuǎn)錄因子的mRNA序列，GenBank編碼號：XM_010314783。SlWHY2全長1162bp，開放閱讀

3、框為726bp，編碼241個氨基酸。
　?。?）利用qRT-PCR對SlWHY2在番茄中表達特性分析表明，SlWHY2基因在葉片中的表達量高于其他組織；轉(zhuǎn)錄水平受聚乙二醇，氯化鈉，水楊酸和過氧化氫的誘導(dǎo)表達。此外，SlWHY2的表達還受到青枯假單胞菌的誘導(dǎo)。
　?。?）構(gòu)建了SlWHY2的pBI121載體，轉(zhuǎn)化野生型煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，通過PCR和qRT-PCR的方法篩選過表達植株，從中選取不同表達量的三個株系（OE-

4、1，OE-3，OE-5）作為后續(xù)試驗材料。
　?。?）在正常的生長條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因煙草植株表型無明顯差異。在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系幼苗及成苗的生長狀態(tài)要優(yōu)于野生型。DAB、N B T染色結(jié)果顯示，干旱處理后，野生型葉片顏色深于轉(zhuǎn)基因煙草，H2O2和O2-含量測定結(jié)果進一步表明野生型煙草的活性氧積累量高于轉(zhuǎn)基因煙草，且轉(zhuǎn)基因煙草的酶活性及相關(guān)酶基因表達水平均高于野生型。這說明SlWHY2過表達提高了煙草抗氧化能力，緩解活性

5、氧對植株的氧化毒害作用。
　?。?）測定干旱處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型葉片的相對含水量、相對電導(dǎo)率、丙二醛以及游離脯氨酸的含量，結(jié)果表明野生型植株的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量明顯高于轉(zhuǎn)基因株系，而相對含水量和游離脯氨酸含量則低于轉(zhuǎn)基因煙草。試驗進一步說明過表達SlWHY2提高煙草的抗?jié)B透脅迫能力。
　?。?）用青枯假單胞菌分別噴施、注射過表達和野生型煙草后，通過DAB和臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草過氧化氫積累量及細胞死亡數(shù)均低于野生型