三七消減文庫(kù)構(gòu)建和皂甙合成關(guān)鍵酶基因克隆及表達(dá).pdf

1、三七(Panax notoginseng(Burk．)F．H．Chen)為五加科人參屬植物，是云南的道地藥材，有“南方人參”之稱。達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂甙是三七的主要活性物質(zhì)，在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗衰老、抗腫瘤等方面均有較好的活性。三七皂甙含量與三七的生長(zhǎng)年限和生長(zhǎng)部位有關(guān)。根部是重要藥用器官，且3年生根的皂甙含量高于1年生根。推測(cè)三七皂甙含量的時(shí)間性差異很可能和皂甙生物合成相關(guān)基因差異表達(dá)調(diào)控有

2、關(guān)。為了解三七達(dá)瑪烷型皂甙合成的分子機(jī)理，必須首先克隆到相關(guān)的差異表達(dá)基因并進(jìn)行深入的研究。 該研究利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了三七1年生根和3年生根cDNA的正反向抑制減消文庫(kù)。結(jié)果表明：正向消減文庫(kù)包括2,000個(gè)cDNA克隆，反向消減文庫(kù)包括500個(gè)cDNA克隆，2個(gè)庫(kù)的重組率都在95％以上，cDNA片段的長(zhǎng)度分布在200～900 bp左右，平均長(zhǎng)度約500 bp左右。消減效率檢測(cè)結(jié)果表明：消減雜交將18S rRNAL對(duì)照基

3、因減弱了32,000倍。以上結(jié)果表明：所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。 對(duì)所得到的正反向消減文庫(kù)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，分別從文庫(kù)中挑選插入片段在500 bp左右的質(zhì)粒200個(gè)，與1年生和3年生DIG標(biāo)記的SSH-探針分別進(jìn)行雜交，篩選到110個(gè)來(lái)自只在三七3年生根中表達(dá)或表達(dá)量增加的基因，80個(gè)來(lái)自只在三七1年生根中表達(dá)或表達(dá)量增加的基因。為進(jìn)一步確定差異表達(dá)基因，我們從斑點(diǎn)雜交的陽(yáng)性克隆中挑選了6個(gè)差異基因進(jìn)行半定量RT

4、—PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明：在3年生根中發(fā)動(dòng)蛋白鳥苷三磷酸酶效應(yīng)子，γ-谷氨酰水解酶，多銅氧化酶Ⅰ型家族蛋白，IspG蛋白，還原型輔酶I氧化酶家族蛋白基因表達(dá)上調(diào)，而S腺苷高半胱氨酸水解酶基因表達(dá)下調(diào)，提示抑制消減雜交篩選到的大多基因如果在3年生根中高表達(dá)，則在1年生根中不表達(dá)或差異表達(dá)。6個(gè)差異表達(dá)基因同源比對(duì)功能分析結(jié)果表明：IspG蛋白是皂甙生物合成途徑中關(guān)鍵酶，其它5個(gè)基因可能與皂甙的合成有直接或間接關(guān)系。 IspG蛋白生物信息學(xué)分

5、析結(jié)果表明.IspG蛋白的EST由524個(gè)核苷酸組成，編碼146個(gè)氨基酸殘基，分子量為15.636 KDa。有1個(gè)與轉(zhuǎn)錄子有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，功能位點(diǎn)有N-豆蔻酰化位點(diǎn)，N-糖基化位點(diǎn)，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。其同源性在植物中達(dá)90％以上，在微生物中達(dá)50％。亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。 對(duì)91個(gè)EST克隆測(cè)序和序列組裝分析結(jié)果表明：有4個(gè)重疊群(Contig)和83個(gè)單拷貝EST(Singlet)，代表了共計(jì)87個(gè)獨(dú)立基因(Unigene)

6、，其中23個(gè)cDNA含有poly A序列，占整個(gè)克隆數(shù)的26.4％。功能分類結(jié)果表明：已知功能的唯一序列共58個(gè)，占66.6％，未知功能唯一序列29個(gè)，占33.3％。對(duì)已知功能基因分類，得到11類，其中大多基因與代謝途徑和分泌途徑有關(guān)。 對(duì)37個(gè)氨基酸序列可通讀的EST進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析結(jié)果表明：3個(gè)克隆有跨膜結(jié)構(gòu)，8個(gè)克隆有信號(hào)肽或是信號(hào)錨定蛋白。功能位點(diǎn)分析結(jié)果表明：大多數(shù)基因與胞外分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋

7、亡和細(xì)胞周期，信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：除10個(gè)克隆沒有預(yù)測(cè)到功能結(jié)構(gòu)域外，其它結(jié)構(gòu)域與信號(hào)傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，電子傳遞等有關(guān)。亞細(xì)胞定位大多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中。 鯊烯環(huán)氧酶是皂甙生物合成途徑過(guò)程中的1個(gè)重要的限速酶。根據(jù)人參鯊烯環(huán)氧酶cDNA序列合成引物，我們從三七根中擴(kuò)增到三七鯊烯環(huán)氧酶全長(zhǎng)cDNA。該基因開放閱讀框含有1，622個(gè)核苷酸，編碼537個(gè)氨基酸殘基，其分子量為59.139 KDa，等電點(diǎn)為8.81(GenB

8、ank登錄號(hào)DQ386734)。同源性分析結(jié)果表明，三七鯊烯環(huán)氧酶與其它生物鯊烯環(huán)氧酶均具有不同程度的同源性。與人參鯊烯環(huán)氧酶同源性達(dá)到9896，進(jìn)化樹的分析為同一祖先。生物信息學(xué)分析三七鯊烯環(huán)氧酶基因含有FAD功能區(qū)，以Rossmann折疊的NAD(P)-結(jié)合區(qū)，F(xiàn)AD/NAD(P)-結(jié)合區(qū)，疏水性，跨膜結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)和基序說(shuō)明三七鯊烯環(huán)氧酶是一個(gè)膜蛋白，可從胞質(zhì)溶膠中分泌出來(lái)。三七鯊烯環(huán)氧酶中含有WD domain，G-beta r