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文檔簡介
1、黃檗是古熱帶區(qū)孑遺植物,經(jīng)歷了從第三紀(jì)炎熱到寒冷等一系列的氣候變遷,對自然界的非生物脅迫(如高溫、干旱、寒冷)有很強的適應(yīng)力,為國家二級保護植物。 為研究干旱脅迫下黃檗的基因表達(dá)情況,本論文以干旱脅迫下的黃檗幼苗cDNA為tester,正常生長的黃檗幼苗組織cDNA為driver,利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH)構(gòu)建了干旱脅迫下黃檗幼苗的消減文庫。從消減
2、文庫中隨機挑取20個陽性克隆,提取質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定,顯示文庫克隆的重組率大于95%,插入片段大部分集中在300~800bp之間。隨機挑取816個克隆進行測序,得到265個基因。將其進行同源性分析,將其劃分為16類,獲得了如熱激蛋白70、脫水響應(yīng)蛋白(RD22)、通用脅迫蛋白、金屬硫蛋白(MT2),晚期胚胎豐富蛋白(LEA14)等44種與干旱脅迫相關(guān)的基因,它們涉及了植物的滲透調(diào)節(jié)、信號傳遞、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、活性氧清除等方面。所得160
3、個EST序列已被GenBank和EST數(shù)據(jù)庫收錄。 從文庫中選取金屬硫蛋白基因(MT2)進一步研究,根據(jù)測序得到的序列設(shè)計MT2特異性引物,通過5’cDNA末端快速擴增(RLM-RACE)技術(shù)克隆了其5’端序列。將5’RACE產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體后,轉(zhuǎn)化測序,并根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計引物,克隆了MT2編碼區(qū)序列,從而得到了MT2的全長序列。黃檗MT2基因mRNA全長852bp,ORF分析表明,其在112bp處具有起始密碼子A
4、TG,315bp處有終止密碼子TGA,具有240bp的完整的開放讀碼框,預(yù)測編碼79個氨基酸。經(jīng)過Blast分析,發(fā)現(xiàn)它在核酸序列上與柑橘、柳樹類MT序列有80%的序列同源性,且同源區(qū)域覆蓋cDNA100%;其假定氨基酸序列與柳樹類MT2A蛋白在55個氨基酸序列中有70%的同源性,說明黃檗金屬硫蛋白與已知MT有明顯的同源性,可以預(yù)測其具有與己知MT類似的功能。 綜上所述,利用SSH技術(shù)構(gòu)建了黃檗幼苗在干旱脅迫下差異表達(dá)基因文庫,
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