茶樹BAC文庫(kù)構(gòu)建與相關(guān)基因克隆的篩選及測(cè)序.pdf

1、茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值不僅體現(xiàn)在茶葉上，茶樹花、果實(shí)也有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。茶被譽(yù)為“世界三大無(wú)酒精飲料之一”，現(xiàn)已成為世界上流行的保健飲品。隨著生物技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，關(guān)于茶樹的科學(xué)研究已經(jīng)逐漸深入至分子生物學(xué)水平，茶樹基因的分離與克隆已成為分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。
　　本課題是與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作完成，以茶樹品種“舒茶早”植株為材料構(gòu)建茶樹BAC

2、(bacterial artificial chromosome)文庫(kù)。該文庫(kù)含有161，280個(gè)克隆，保存在420塊384板中。隨機(jī)挑選450個(gè)BAC克隆檢測(cè)DNA插入片段，片段大小集中在100～130 kb之間，平均插入片段約為113kb，空載率小于2.5％，以茶樹基因組2.9 Gb計(jì)算，該文庫(kù)大約覆蓋整個(gè)茶樹基因組6.2倍。隨機(jī)挑選48個(gè)BAC克隆測(cè)BAC末端序列，參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中茶樹細(xì)胞器基因組序列信息，對(duì)BAC末端序列進(jìn)行

3、比對(duì)。Blastn分析表明隨機(jī)挑選的48個(gè)克隆中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞器污染的克隆存在。
　　建立高效率的2步PCR篩選基因的方法對(duì)“舒茶早”茶樹BAC文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得7個(gè)含有茶樹功能基因(Csi092H17、Csi020O15、Csi044B12、Csi274K14、Csi271P8、Csi106D7、Csi047O18)的BAC克隆。首先構(gòu)建420個(gè)一級(jí)混合池用于第一輪PCR篩選，隨后對(duì)第一輪PCR篩選出的384板構(gòu)建行池和列池，用