Pima90-53細菌人工染色體（BAC）文庫構建及抗黃萎病相關基因篩選.pdf

1、棉花是當今人類栽培的主要作物之一和天然纖維的首要來源。目前，四倍體的陸地棉(GossypiumhirsutumL.)和海島棉(GossypiumbarbadenseL.)是世界各國的主要栽培種，它們分別占世界棉花總產量的90﹪和8﹪。海島棉纖維細長、強力高、抗病性較強，是品質最優(yōu)的栽培種。因此構建海島棉品種的BAC文庫，利用國內外已有分子標記探針釣取和分析含有重要性狀的BAC克隆，是發(fā)掘分子標記、克隆纖維發(fā)育相關基因和抗病基因、深入開展

2、棉花功能和比較基因組學研究的基礎和關鍵。對于顯著提高我國棉花遺傳育種研究水平具有重要意義和應用前景。 本研究以優(yōu)質抗病海島棉品種Pima90-53為材料，在本課題組BAC文庫構建方法的基礎上，進行了一些改進，補充構建了該品種的BAC文庫，獲得了77,568個克隆，使得該文庫的克隆總數(shù)達到167,424個。 隨機挑取224個克隆進行插入片段大小檢測，其平均片段大小介于50kb～260kb之間，平均插入片段為130kb，94

3、﹪的插入片段在100kb以上，空載率小于4﹪；該基因組文庫中葉綠體基因的污染率低于0.2﹪；該文庫覆蓋海島棉基因組的7.2倍；Southern雜交結果表明所構建的Pima90-53BAC文庫具有較高的忠實度；隨機挑取7個克隆進行繼代培養(yǎng)100代，提取質粒酶切檢測表明不存在片段丟失現(xiàn)象，表明該文庫的克隆在大腸桿菌中能夠穩(wěn)定保存；用單拷貝的分子標記Fb38和多拷貝的分子標記MYB作為探針對該文庫進行了部分篩選，分別得到2個和40個陽性克隆。

4、這些結果表明該文庫具有較高的質量，為開展棉花重要性狀基因的圖位克隆、棉花物理作圖、基因組測序和SSR引物開發(fā)等應用提供了重要基因組資源。 以黃萎病菌誘導下差異表達的棉花抗病相關基因片段PR8為探針，利用雜交方法，對所構建的優(yōu)質、抗病海島棉品種Pima90-53BAC文庫進行了篩選。從30,336個BAC克隆中篩選到含有PR8基因片段的4個陽性克隆，分別為127K13、128D14、169J3和178C5。用Sau3AⅠ對其中的1

5、69J3克隆進行酶切，回收2kb～4kb的DNA片段并連接到載體pUC118BamHⅠ-BAP上，構建了含有該基因片段的亞克隆文庫，該文庫共含有4,224個克隆，平均插入片段為2kb。通過對亞克隆的測序分析初步得到了一條與轉運蛋白相關的基因片段，該片段長2.3kb，含有五個開放閱讀框。通過比對分析發(fā)現(xiàn)該基因片段與水、冷害、莖點霉屬脅迫下表達的基因有較高的同源性，該片段可能在棉花抗病反應的信號傳導中起作用。該基因片段的獲得為得到抗黃萎病相