茶樹幼根SET文庫構建及茶氨酸代謝相關基因表達分析.pdf

1、茶氨酸系茶樹中的特征性非蛋白質氨基酸，是構成茶葉品質的主要成分之一，影響茶葉的滋味品質，具有重要的保健功能和藥理作用。目前與茶氨酸代謝相關的分子機理還知之甚少。因此，研究茶氨酸代謝途徑上相關的基因，特別是茶氨酸合成的關鍵酶基因及調控因子等，將為進一步明晰茶氨酸代謝途徑及利用轉基因生產茶氨酸提供基礎?；诓璋彼岷铣捎诓铇涓恳约巴贫ǖ那绑w物為鹽酸乙胺和谷氨酸鈉，作者先在沙培的龍井43 茶苗培養(yǎng)介質中添加茶氨酸合成的前體物激活茶氨酸代謝途徑

2、，然后選取茶氨酸合成器官——茶苗幼根作為試材，構建cDNA文庫并進行ESTs測序分析；另一方面，篩選出茶氨酸含量差異的材料，通過實時熒光定量PCR初步分析茶氨酸代謝相關基因的差異表達。為今后構建基因芯片或數(shù)字化的基因表達譜來獲取茶氨酸代謝相關的功能基因、調控因子以及深入了解茶氨酸合成及相關氮代謝機理提供研究基礎。具體研究結果如下。
　　 1.由于采用現(xiàn)有的茶樹RNA 提取方法提取茶苗幼根中的RNA 難以取得良好的效果，作者在提取

3、茶苗幼根RNA的過程中，對幾種RNA 提取方法進行了比較，結果顯示改良的CTAB 法提取茶苗幼根等組織中的RNA 完整性好、純度高，可以滿足構建cDNA文庫的要求。
　　 2.以茶苗幼根為材料，采用SMART 技術構建cDNA文庫并對其質量進行了鑒定。
　　 結果顯示該文庫的重組率為92％，庫容量為5.0×105，平均插入片段長度超過1 kb，可以滿足后續(xù)的大規(guī)模測序等要求。從文庫中隨機挑選克隆并從5’端單向測定5160

4、個克隆，獲得4860個有效的ESTs，序列長度從100 至1850 bp，平均長度為617 bp（部分序列已登錄GenBank，登錄號為GE652554–FE861258）。用Phrap 軟件進行拼接，共獲得1809個unigenes，其中，648個為contigs，1161個為singletons；與NCBI的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫進行BlastX 比對以及Blast2go 注釋，將已知或推定的功能基因進行了分類，并通過Kegg分析其中涉及

5、到次生代謝及氨基酸代謝相關的基因。結果顯示，1041個unigenes（57.6％）相似于已知或推定功能的蛋白（E-value＜1E-5），282個（15.5％）相似于未知功能的蛋白，486個（26.9％）沒有比對上任何蛋白，推定為新的表達基因。將比對上的編碼已知或推定功能蛋白的基因進一步分類，蛋白質合成類別占13.06％，與防衛(wèi)相關的為8.84％，轉運蛋白占8.65％。與次生代謝相關的功能基因占4.52％，其中測到序列數(shù)量最多的為編碼

6、細胞色素P450的功能基因，共有7個；此外，還有編碼黃酮3-O-葡糖基轉移酶、類黃酮3-葡糖基轉移酶、p-香豆酰輔酶A 三羥化酶、花青素 5-O-葡糖基轉移酶、松柏醇?；D移酶及咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶等基因。Kegg pathway分析結果顯示，與次生代謝相關的基因主要參與類黃酮、異黃酮、苯丙素、萜類化合物、二萜、花青素、黃酮和黃酮醇的生物合成代謝途徑，其中最主要的是涉及黃酮代謝途徑。與初級代謝相關的基因為17.39％，其中氨基酸

7、相關的基因中有涉及氮代謝和茶氨酸合成的谷氨酰胺合成酶、S 腺苷甲硫氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、γ-谷氨酰轉肽酶、亞硝酸還原酶及胞質氨肽谷氨酰胺氨基轉移酶等，主要參與蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和谷胱甘肽等氨基酸的代謝。其他涉及胞內運輸、信號轉導、蛋白質降解與儲存、能量、轉錄、細胞結構與細胞生長及未知功能基因分別占1.16％、6.63％、4.23％、5.57％、9.70％、7.69％和10.56％。
　　 3.在

8、茶愈傷組織中添加茶氨酸合成的前體物、代謝中間產物及信號分子等成分，應用高效液相色譜分析愈傷組織生長過程中茶氨酸的變化及其在對照與處理之間的差異。分析了茶苗水培中添加 (NH4)2SO4 誘導前后的茶氨酸含量變化，同時對遮陰、遮陰與水楊酸或鹽酸乙胺組合處理以及不同品種的茶苗嫩葉中茶氨酸含量差異也進行了初步地探討。試驗結果顯示，培養(yǎng)基中添加25mM 鹽酸乙胺后，在茶愈傷組織生長6 d和12 d 時，與對照相比，茶氨酸含量增加最為明顯。因此選

9、取對照和鹽酸乙胺誘導的茶愈傷組織作為差異表達材料進行后續(xù)的候選茶氨酸代謝相關基因的差異表達分析。
　　 4.為了選取合適的內參基因來分析前體物誘導及對照的茶愈傷組織中茶氨酸代謝相關基因的差異表達，作者利用GenBank 上登錄的茶樹基因序列以及通過構建文庫測序所得的基因（具有完整的閱讀框）共7個持家基因設計引物，在分析這些引物的擴增效率和特異性后，測定了它們在茶愈傷組織生長過程中（對照和愈傷培養(yǎng)基中添加外源物的情況下）的表達水平

10、。利用geNorm和NormFinder 軟件分析了這些持家基因的穩(wěn)定性，確定在該條件下合適的內參基因為β-actin和GAPDH。
　　 5.選取11個推定的與茶氨酸代謝相關的基因，利用Primer premier 5設計引物，利用qRT-PCR定量分析它們在茶氨酸含量差異明顯的茶愈傷組織中表達量的差異。
　　 試驗結果顯示：GS1-1、gogat、NIR和GDH2在愈傷組織培養(yǎng)初始3 d的表達量在處理組被明顯地誘導，