DON誘導望水白cDNA文庫構建與基因表達分析.pdf

1、由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是世界溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生的一種嚴重性病害。該病發(fā)生后，不僅造成產(chǎn)量損失，而且病麥粒中含有多種危害人、畜健康的單端孢霉烯族毒素，其中脫氧血腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡稱DON)危害最大，但是有關小麥抗DON遺傳機制方面的研究報道較少。本研究以我國高抗赤霉病小麥品種望水白為試材，構建了DON誘導cDNA文庫，并通過EST測序、半定量RT-PCR和染色體定位分析，旨在揭示DON誘導后小麥

2、基因的表達特點，為小麥抗DON遺傳育種研究提供新的信息。研究結果如下： 選取抽穗后2d的望水白穗子，通過單花滴注接種DON(100mg·kg-1)，分別提取誘導24 h和48 h的RNA等量混合后，使用SMART文庫構建試劑盒構建了DON誘導穗組織λ噬菌體cDNA文庫，滴度測定表明，初始文庫滴度為3x106 pfu/mL，重組率達95％，能夠代表mRNA的復雜度，擴增后的文庫滴度為2×109 pfu/mL；初始文庫直接轉入大腸桿

3、菌BM25.8，經(jīng)檢測，其插入片段介于500～2000 bp，平均1053 bp。 隨機挑選96個克隆進行3'端測序，測序長度介于60-891bp，平均393 bp。選取48條長度大于300 bp的EST在NCBI的GenBank中用BLAST軟件進行比對后將其分成6類：(1)核糖體蛋白基因6條(13％)；(2)初級代謝與次生代謝相關基因8條(18％)；(3)DNA結合、RNA加工相關蛋白基因4條(9％)；(4)免疫或逆境相關蛋

4、白基因5條(11％)；(5)未知功能基因9條(20％)；(6)未發(fā)現(xiàn)顯著同源性的基因13條(29％)。 根據(jù)這些序列，共設計17對新的小麥EST-PCR引物，并成功用于半定量RT-PCR擴增。以DON誘導0、6、12、24、48、72、96、120 h的望水白穗組織cDNA為模板，半定量分析發(fā)現(xiàn)，14個EST基因表現(xiàn)上調表達，1個基因表現(xiàn)下調表達，2個基因表達無差異。 利用一套中國春缺體-四體進行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，cl