茶樹cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及新梢特異表達(dá)基因EST序列分析.pdf

1、茶樹是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物.茶葉是世界最流行的飲料之一,對(duì)人體有重要的生理保健作用.為了更好了解茶樹新梢表達(dá)基因,并篩選出感興趣的目的基因,該文構(gòu)建了龍井43和安吉白茶等兩個(gè)品種的新梢cDNA文庫(kù),并對(duì)龍井43文庫(kù)進(jìn)行較高通亮通量的EST測(cè)序和生物信息學(xué)分析.該研究獲得的主要結(jié)果如下:1.以Trizol一步法從春茶新梢中提取總RNA,分離純化富含Poly A的mRNA,LD-PCR反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,以λTripEX2為載體,構(gòu)建了龍

2、井43新梢cDNA文庫(kù),.文庫(kù)的滴度分別為6.8×10<'5>pfu/mL和4×10<'5> pfu/mL,符合高質(zhì)量文庫(kù)的要求,.文庫(kù)的重組率為98.05﹪和96.15﹪,且插入片段的長(zhǎng)度在1.0-1.5kb左右,說明文庫(kù)是完整的、有效的.兩個(gè)文庫(kù)總克隆數(shù)分別為3.5×10<'5>個(gè)和2.1×10<'5>個(gè),高于所需標(biāo)準(zhǔn).2.為了獲得高質(zhì)量的EST序列,利用原來λTriplEx2載體獲得的質(zhì)粒,在pUCM-T載體上引入2個(gè)SfiI酶切

3、位點(diǎn)后,構(gòu)建了一個(gè)新載體SFiI-pUC.用新載體構(gòu)建一個(gè)用于測(cè)序的質(zhì)粒文庫(kù).3.從龍井43新梢cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中隨機(jī)選取4320個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)EST標(biāo)準(zhǔn)獲得長(zhǎng)度大于200bp的有用序列為2963個(gè),測(cè)序成功率為占總克隆的68.60﹪.通過DNATool軟件進(jìn)行冗余度分析后去除的重復(fù)序列有863個(gè),占總獲得序列的33.88﹪,獲得有效ESTs 1684個(gè),其平均長(zhǎng)度為478bp.4.所有有效序列與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),有36.

4、0﹪序列(607EST)序列顯示了與已知序列高度的同源性;而與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)時(shí)有71.3﹪的序列(1200 EST)顯示了與已知序列的高度的同源性,并建立了茶樹新梢特異表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù).5.有效序列BlastX分析表明,豐度較高的基因(表達(dá)頻率≥5)約有30個(gè),約占總數(shù)的10﹪;中等豐度基因(表達(dá)頻率在2-5之間)約100個(gè),占總數(shù)的30﹪;其余低豐度的基因約占60﹪.說明在茶樹新梢中基因大多數(shù)呈中低豐度表達(dá).6.結(jié)合擬南芥功能基因

5、分類標(biāo)準(zhǔn),把通過BlastX比對(duì)獲得茶樹新梢有功能描述基因(包括功能確定的及推測(cè)功能的)分為12類,即能量代謝相關(guān)基因(Energy),占功能基因總數(shù)的26.39﹪、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因(Protein synthesis)占17.86﹪、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(Cellstructure)占10.71﹪、細(xì)胞抗性及防御相關(guān)基因(Disease and defence)占9.23﹪、代謝相關(guān)基因(Metabolism)占8.33﹪、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)

6、基因(Cellular signaltransduction)占5.36﹪、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因(Cellular transporters)占4.66﹪、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(Transcription)占3.87﹪、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因(Cell growth and division)占3.77﹪、次生代謝相關(guān)基因(Secondary metabolism)占3.47﹪、蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因(Protein destination and s