山葡萄成熟果皮cDNA文庫的構建及EST分析.pdf

1、山葡萄是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料,用山葡萄釀造的葡萄酒口味獨特,深受國內外消費者的歡迎。為了研究山葡萄成熟過程中相關基因的表達情況,鑒定出與山葡萄成熟、香氣物質形成、花色苷合成及抗病相關的基因,進行了以下研究:
　　 通過三種RNA提取方法提取山葡萄成熟果皮的總RNA,其中改良的CTAB法能分離出高質量的RNA,可以用于下一步的分子生物學研究。以山葡萄成熟果皮為材料,采用Creator SMARTTM cDNA Librar

2、y Construction技術構建了cDNA文庫。經鑒定,文庫的庫容量為1.001x106,重組率為94％,插入片段在0.25～2.0 kb之間。經隨機測序,獲得935條有效EST,聚類拼接后得到636條單基因簇(unigenes),包括108個重疊群(contigs)和528個單拷貝(singlets)。這些數據為今后山葡萄功能基因的分離克隆和功能基因組學的研究奠定了基礎。
　　 EST分析結果表明,文庫中未知功能基因(fu

3、nction unknown)占17.92％,控制代謝(metabolism)的基因為20.81％,與細胞救援與防御(cell rescue,defence)相關的基因為5.15％,信號轉導(signal transduction)基因為4.68％,能量(energy)相關基因為5.61％,蛋白合成(protein synthesis)相關基因為9.59％,蛋白活性調節(jié)(protein activityregulation)基因為15.

4、43％,細胞結構(cell structure)基因為9.12％,控制運輸(transport)基因為6.55％,轉錄(transcription)基因為5.15％。
　　 在文庫中,核糖體蛋白的數量最多,為28個,占全部EST序列的5.38％,有比較多的核糖體蛋白說明在山葡萄果皮生命活動過程中,蛋白質合成活動旺盛。文庫中與花色苷合成相關的基因包括查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)、類黃酮3’,5’羥化酶(

5、flavonoidflavonoid3’,5’-hydroxylase,F3’5’H)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases,GST)等,這些基因都與已知基因或者基因家族有高度相似性(Evalue<10-15,Identity>80％)。文庫中與香氣物質形成相關的基因主要有脂肪氧化酶(Lipoxygenase)、苯丙氨酸解

6、氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase)、醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase)等8個酶基因,與成熟相關的基因有多聚半乳糖酶(Polygalacturonase)、成熟相關蛋白grip22(Ripening-related protein grip22)、果膠酶(Pectinesterase)、脂肪氧化酶(Lipoxygenase)。根據已有的文獻資料,從山葡萄成熟果皮的cDNA文庫中挑選了23個和