巖溪晚蘆成熟果皮與果肉差減cDNA文庫的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，已成為世界第二大柑橘生產(chǎn)國。然而長期以來，我國柑橘品種早、中、晚熟熟期搭配不合理、晚熟品種偏少的問題一直未能得到有效的解決，國產(chǎn)柑橘每年有半年的空檔期，國外則乘虛而入，逐漸占領(lǐng)柑橘類水果的高端市場(chǎng)。因此，如何實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)柑橘鮮果周年均衡供應(yīng)頗為重要。 巖溪晚蘆(Citrus reticulata)是我國從普通槿柑選出的晚熟變異品種，相同條件下，其成熟期比普通椪柑遲40-60天，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，耐寒性較強(qiáng)。巖溪晚蘆

2、果實(shí)成熟過程中，果皮和果肉必然有著各自不同的內(nèi)在作用機(jī)理，受其自身一系列基因的表達(dá)與調(diào)控作用。有效發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異基因具有十分重要的意義。 本研究以椏柑成熟果皮為材料，利用抑制性差減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)，富集椪柑果皮和果肉的差異表達(dá)基因，構(gòu)建了巖溪晚蘆果皮與果肉的差減cDNA文庫，通過對(duì)文庫篩選、克隆測(cè)序和功能分析，發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異

3、基因，以便為今后進(jìn)一步的基因功能分析、全長基因克隆及基因改造等研究打下基礎(chǔ)。 分別以成熟椏柑果肉作為抑制性差減文庫的實(shí)驗(yàn)材料(Driver)、以成熟果皮作為抑制性差減文庫的材料(Tester)，采用自行改進(jìn)的LiCl沉淀法，分別提取以上兩種材料的總RNA，按照Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒操作分離純化mKNA，獲得了高質(zhì)量的mRNA。采用SSH試劑盒操作方法進(jìn)行抑制性差減雜交，先將兩種材料mRNA行反轉(zhuǎn)錄成雙

4、鏈cDNA，經(jīng)Rsa Ⅰ酶切，再將Tester酶切產(chǎn)物分成兩份：一份與Adoptorl連接，另一份與Adoptor2R連接；將抑制性差減雜交第二次PCR的產(chǎn)物純化后連接至pTZ57R/T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)向斑篩選、培養(yǎng)，用T/A克隆法，DH5 α為受體菌，菌斑經(jīng)統(tǒng)計(jì)共9784個(gè)，其中藍(lán)斑87個(gè)，差減文庫重組率達(dá)99.1％。構(gòu)建了庫容量為1019個(gè)克隆的差減cDNA文庫。隨機(jī)對(duì)文庫中100個(gè)白色克隆抽提質(zhì)粒后檢測(cè)，有

5、96個(gè)陽性克隆均能檢測(cè)到明顯的條帶，插入片段長度集中在100～500bp，與預(yù)期插入片段相一致。隨機(jī)挑選了770個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，成功測(cè)出411個(gè)EST，其中有377個(gè)與已知基因具有較高的相似性，它們分屬126個(gè)基因，其中1個(gè)基因出現(xiàn)頻率最高達(dá)31次，為假想的一種蛋白；1個(gè)基囚出現(xiàn)頻率達(dá)28次，為未命名的蛋白產(chǎn)物；1個(gè)基岡出現(xiàn)頻率達(dá)25次，為假想的葉綠體RF1；5個(gè)基因出現(xiàn)頻率在10～20之間；55個(gè)基因出現(xiàn)頻率在2～1之間，其中大部分集

6、中在2～5之間；63個(gè)基因只出現(xiàn)1次。文庫中，低拷貝基因和高拷貝基因同時(shí)存在。這些基因涉及到了色素合成、能量代謝、初級(jí)代謝、次生代謝、抗逆防御、蛋白代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、香味形成、果皮軟化(衰老)、精油代謝、抗氧化代謝、澀味消失以及結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)、基因表達(dá)等等生理生化過程，大多均為果皮組織特異表達(dá)基因。另外還有涉及到澀味變化、三價(jià)鐵螯合物、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gag蛋白、查爾酮、硼離子轉(zhuǎn)運(yùn)、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶等功能的基因。功能已知且不重復(fù)的EST共有6