高溫誘導(dǎo)的甘藍(lán)抑制性差減雜交文庫(kù)構(gòu)建及其ESTs分析.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata）簡(jiǎn)稱甘藍(lán)，起源于地中海沿岸，16世紀(jì)時(shí)傳入我國(guó)。由于甘藍(lán)抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，容易栽培，目前在世界各地均有栽培，也成為我國(guó)各地普遍種植的一種重要蔬菜。甘藍(lán)是一種喜冷涼的蔬菜作物，其結(jié)球期適溫為15-20℃，能適應(yīng)的溫度為7～25℃，超過(guò)25℃則同化減弱，呼吸加強(qiáng)，結(jié)球疏散，品質(zhì)和產(chǎn)量降低。因此，高溫已成為甘藍(lán)生產(chǎn)的限制因子，生產(chǎn)上迫切需要解決高溫危害的問(wèn)題。然而，只有

2、深入研究甘藍(lán)的耐熱機(jī)制，才能從根本上解決這個(gè)問(wèn)題。本研究運(yùn)用抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，應(yīng)用EST技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)甘藍(lán)耐熱相關(guān)基因的表達(dá)分析，從基因水平來(lái)研究甘藍(lán)耐熱機(jī)制。為今后的甘藍(lán)耐熱遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)以耐熱結(jié)球甘藍(lán)自交系“夏皇6-105”為材料，構(gòu)建了經(jīng)高溫誘導(dǎo)0.25h、1h、3h、6h、12h后的甘藍(lán)葉片混合SSHcDNA文庫(kù)。共得到1010個(gè)單菌落，其中自斑839個(gè)

3、，隨機(jī)挑取300個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)反向Northern雜交驗(yàn)證，107個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后測(cè)序，共得到105條高質(zhì)量的ESTS。CAP3軟件聚類后共獲得45個(gè)Unigenes，包括7個(gè)Contigs和38個(gè)Singlets。利用BLASTx、BLASTn在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這45條Unigenes進(jìn)行同源性比對(duì)，熱激蛋白10個(gè)，種類有ATHSP101、HSP70、HSP81.4、HSP70b、HSP22、HSP21、HSP18、HSP23

4、.6。其它的與初級(jí)代謝和能量代謝相關(guān)基因5個(gè)；轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因2個(gè)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因2個(gè)；蛋白質(zhì)修飾、加工相關(guān)基因9個(gè)；轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因2個(gè)；功能未知的Unigene有7個(gè)；4個(gè)Unigenes比對(duì)同源性非常低：4個(gè)Unigenes在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何同源性。
　　 進(jìn)一步對(duì)所得的Unigenes分析發(fā)現(xiàn)：鈣信號(hào)在甘藍(lán)抗熱過(guò)程中起到了一定的作用，并與外界的非生物脅迫存在某種相同的機(jī)制，但具體機(jī)制還不清楚；泛素-蛋白酶體途徑在植物熱激