雞白痢沙門氏菌抑制差減雜交文庫的構(gòu)建及ipaJ、mobA基因的克隆與表達(dá).pdf

1、雞白痢沙門氏菌多侵害20日齡以內(nèi)幼雛，引起白色下痢，病死率極高，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。該病既可垂直傳播，又有嚴(yán)重的水平傳播，所造成的危害和經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前，在西方發(fā)達(dá)國家該病已經(jīng)被消滅或基本消滅，然而在個別小的禽群中仍有發(fā)生，國內(nèi)禽群雞白痢的爆發(fā)仍較多。尋求雞白痢沙門氏菌的致病基因?qū)τ诹私馄渲虏C(jī)理及有效地防治雞白痢具有重要的意義。 隨著微生物基因組序列的大量測定，通過比較基因組差異分析致病微生物的分子致病機(jī)制已成為新

2、近微生物基因組研究的一大熱點(diǎn)。抑制性差減雜交方法(suppression subtractive hybridisation，SSH)的問世為微生物基因組學(xué)研究、致病基因和新基因的篩選提供了新技術(shù)。本研究利用SSH構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌與腸炎沙門氏菌的差減文庫，并對其中的部分序列進(jìn)行了初步分析。 1．雞白痢沙門氏菌與腸炎沙門氏菌抑制差減雜交文庫的構(gòu)建應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)(SSH)對雞白痢沙門氏菌533株與腸炎沙門氏菌50041

3、株進(jìn)行基因組片段的差異分析，構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌的差減文庫。經(jīng)Dot-blot篩選，并對部分片段測序和同源性分析，結(jié)果表明這些序列主要分為4類：可移動遺傳元件，Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)序列，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移相關(guān)序列，未知功能序列。其中3個差減片段與編碼福氏志賀菌侵入質(zhì)粒抗原IpaJ蛋白基因的同源性達(dá)50％。本研究中構(gòu)建的差減文庫為研究雞白痢沙門氏菌特異性致病基因和其致病機(jī)理提供了重要的材料。 2．雞白痢沙門氏菌ipaJ基因的克隆與表達(dá)雞白痢沙

4、門氏菌與腸炎沙門氏菌差減文庫中的片段PEA2、PE31、PE44與豬霍亂沙門氏菌psfD10 ipaJ相應(yīng)序列同源性分別達(dá)97％、99％和100％。將PEA2、PE31和PE44序列拼接后獲得雞白痢沙門氏菌完整的ipaJ序列，設(shè)計一對引物從雞白痢沙門氏菌中克隆出ipaJ基因并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上，誘導(dǎo)表達(dá)出37KDa的蛋白。Western-blot試驗(yàn)顯示雞白痢沙門氏菌陽性血清能與體外表達(dá)的蛋白呈現(xiàn)特異性反應(yīng)。特

5、異性實(shí)驗(yàn)表明ipaJ是雞白痢沙門氏菌特有的基因。對97株不同來源的雞白痢沙門氏菌分離株的PCR結(jié)果反映了ipaJ廣泛存在于雞白痢沙門氏菌中。本研究在國際上首次證實(shí)了ipaJ基因存在于雞白痢沙門氏菌中，但對其功能的了解還有待于更深入的研究。 3．雞白痢沙門氏菌mobA基因的克隆與表達(dá)雞白痢沙門氏菌與腸炎沙門氏菌抑制差減雜交文庫中片段PE30與豬霍亂沙門氏菌psfDlO mobil基因序列同源性達(dá)99％。根據(jù)GenBank上發(fā)表的mobA基

6、因序列，設(shè)計了一對引物從雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株533中擴(kuò)增出片段約為1.6kb的序列，將此序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30a(+)和pGEMX6p-1上，再將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)和BL21中，在37℃，0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，分別表達(dá)出分子量約為64KDa和84KDa的蛋白質(zhì)。將BL21(DE3)中的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His純化柱回收后免疫小鼠，Western-blot試驗(yàn)顯示免疫小鼠的血清與BL21中