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文檔簡介
1、雞白痢是由雞白痢沙門菌引起,各種日齡雞均可感染的一種急性或慢性傳染病,該病既可水平傳播又可垂直傳播,對家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展存在巨大威脅。國家動(dòng)物疫病長期控制規(guī)劃中對種雞群提出凈化要求,如何有效減少沙門菌的帶菌率是目前亟待解決的問題。疫苗免疫可有效地降低雞群的帶菌率,對種群的凈化具有積極作用。因此,研制安全、有效的基因缺失疫苗用于區(qū)別自然感染與疫苗免疫顯得尤為重要。關(guān)于沙門菌等革蘭氏陰性菌的研究表明,脂多糖不僅是合成外膜的重要組成部分,也是細(xì)
2、菌發(fā)揮毒力的重要因子。隨著人們對沙門菌的致病機(jī)理、毒力基因、脂多糖及疫苗應(yīng)用研究的不斷深入,通過基因工程方法制備減毒活疫苗已取得重大成就,并顯示出良好的應(yīng)用前景。
本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建雞白痢沙門菌LPS合成相關(guān)基因的缺失株,并對其相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行評價(jià);其次,通過評價(jià)各沙門菌缺失株的毒力和免疫效力,為雞白痢沙門菌減毒活疫苗候選株的篩選奠定基礎(chǔ)。
1.雞白痢沙門菌LPS合成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建
根據(jù)
3、雞白痢沙門菌S6702株的LPS合成相關(guān)基因rfbA、rfaL、 rfaJ、rfaI、rfaG、rfaF設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增后利用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建雞白痢沙門菌缺失株S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL、S6702Δrfa、S6702ΔrfaI、S6702ΔrfaG和S6702ΔrfaF。通過PCR擴(kuò)增及序列測定證實(shí)缺失株構(gòu)建成功。生長曲線測定顯示,缺失株與野生株的生長速率無顯著性差異。生物被膜形成能力測定顯示,與野生株相
4、比,S6702ΔrfaJ和S6702ΔrfaF的生物膜形成能力無顯著性差異,S6702ΔrfbA和S6702ΔrfaI的生物膜形成能力顯著增強(qiáng),而S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG的生物膜形成能力顯著減弱。提取脂多糖進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果表明6株缺失株LPS的分子量相應(yīng)變小,顯示LPS的糖鏈合成受阻,進(jìn)一步證實(shí)缺失突變株構(gòu)建成功。
2.雞白痢沙門菌基因缺失株的致病性和免疫原性評價(jià)
通過肌肉接種2日齡SPF
5、雛雞,測定其半數(shù)致死量(LD50),結(jié)果顯示野生株S6702的LD50為3.2×108CFU,缺失株S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL、S6702ΔrfaJ、 S6702ΔrfaI、S6702ΔrfaG和S6702ΔrfaF的LD50分別為>1.5×109 CFU、>1.5×109 CFU、1.4×109CFU、>2.2×109 CFU、>1.0×109 CFU、>2.5×109 CFU,LD50結(jié)果說明缺失株的致病力較野生株均
6、下降。免疫原性評價(jià)試驗(yàn)中,2日齡SPF雛雞免疫后S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG免疫組的體重與健康對照組相比無顯著差異,S6702Δrfa、S6702ΔrfaI和S6702ΔrfaF免疫組的體重明顯下降。玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)野生株血清與S6702抗原產(chǎn)生凝集反應(yīng),缺失株免疫血清與S6702抗原不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。利用間接ELISA檢測血清中IgG抗體,免疫10天后IgG抗體水平較低。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明,對2日齡
7、SPF雛雞免疫后10天進(jìn)行野生株S004攻毒,缺失株均能提供完全保護(hù)。將缺失株免疫30日齡SPF雞,利用間接ELISA法檢測血清中抗體,結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后所有缺失株均可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體,玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)缺失株免疫血清無凝集抗體產(chǎn)生。因此,S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG缺失株具有較好的免疫原性,且不產(chǎn)生凝集抗體。
3.雞白痢沙門菌基因缺失株的免疫效力試驗(yàn)
根據(jù)免疫保護(hù)評價(jià)篩選出S67
8、02ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔaG進(jìn)行免疫效力評價(jià),免疫后7、14和21天分別采集血清進(jìn)行間接ELISA檢測,免疫后7天可檢測到陽性抗體,第21天IgG抗體陽性率接近100%。采集外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示,免疫14天后S6702ΔrfaL免疫組的雞外周血內(nèi)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例上升,表明細(xì)胞免疫水平有所提高。疫苗組體內(nèi)分布試驗(yàn)表明,在免疫21天后,在雞肝臟和脾臟內(nèi)的缺失株細(xì)菌基本被清除。免疫保護(hù)試
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