雞腸炎沙門(mén)氏菌SM6△cpxR-lon-hilA和SM6△cpxR-lon-hilA-cpdB基因缺失株的構(gòu)建及其保護(hù)效力評(píng)價(jià).pdf

1、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica，SE）是一種兼性細(xì)胞內(nèi)病原菌，能夠引起多種動(dòng)物發(fā)病。疫苗免疫是阻止SE進(jìn)入食物鏈的一種有效方式，相對(duì)于滅活疫苗而言，弱毒疫苗對(duì)預(yù)防SE的腸道定植和全身性感染具有更好的效果。因此，研究一種安全、有效的疫苗是控制SE傳播的首要任務(wù)。
　　SE存在許多毒力相關(guān)基因，這些毒力相關(guān)基因的連鎖作用，能夠保證SE在營(yíng)養(yǎng)缺乏的特殊宿主環(huán)境中生存并避免被宿主免疫系統(tǒng)清除。SE入侵宿主細(xì)胞是沙門(mén)氏

2、菌感染的一個(gè)重要階段，其入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程需要侵襲基因的表達(dá)，hilA基因是對(duì)侵襲基因表達(dá)控制的一個(gè)主導(dǎo)者。環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶（cpdB）基因可以水解細(xì)胞內(nèi)第二信使（cAMP，環(huán)磷酸腺苷或cGMP，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷），從而終結(jié)這些第二信使所傳導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞活動(dòng)有重要調(diào)節(jié)功能的生化作用。為了進(jìn)一步致弱SE的毒力，本研究通過(guò)Red重組的方法，在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建雙基因缺失菌株SM6△cpxR/lon基礎(chǔ)上，通過(guò)缺失hilA基因和cpdB基因構(gòu)建了無(wú)抗性標(biāo)

3、記的三基因缺菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB，對(duì)基因缺失菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，并開(kāi)展了缺失株的致病性試驗(yàn)、免疫條件優(yōu)化和免疫攻菌試驗(yàn)，為研究開(kāi)發(fā)SE基因工程弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括:
　　(1)三基因缺失菌株和四基因缺失菌株的構(gòu)建
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出兩端與雞腸炎沙門(mén)氏菌6(SM6) hilA基因上、下游同源臂且中間為氯霉素抗性基因

4、的DNA片段，電擊轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pKD46的SM6△cpxR/lon中，獲得替換hilA基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（SM6△cpxR/lon△:hilA∷Cat），再導(dǎo)入溫度敏感質(zhì)粒pCP20去除氯霉素抗性基因，通過(guò)PCR與序列測(cè)定鑒定，成功構(gòu)建了hilA基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步缺失了cpdB基因，從而構(gòu)建了四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB。
　　(2)基因缺失菌株的生物學(xué)特性

5、研究
　　將獲得的三基因缺失菌株和四基因缺失菌株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過(guò)PCR鑒定，表明三基因缺失菌株和四基因缺失菌株均能夠穩(wěn)定遺傳。將野生株SM6、三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB于LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，繪制其生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA與親本株SM6在體外增殖能力沒(méi)有明顯差異，而四基因缺失株SM6△cpxR/lon

6、/hilA/cpdB的生長(zhǎng)能力明顯弱于三基因缺失株和親本株，說(shuō)明hilA基因的缺失沒(méi)有影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度與能力，而cpdB基因的缺失會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度產(chǎn)生一定的影響。利用微生物鑒定系統(tǒng)，測(cè)定SM6、三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB對(duì)95種碳源的利用能力。結(jié)果表明，在碳源利用能力上，從四基因缺失菌株到三基因缺失菌株再到SM6親本株依次減弱。
　　(3)基因缺

7、失株對(duì)雛雞的致病性試驗(yàn)
　　LD50試驗(yàn)結(jié)果表明，三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB LD50是SM6 LD50的215倍，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB LD50是SM6 LD50的1931倍，三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB的毒力均有所下降，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB的

8、毒力下降了將近2000倍，對(duì)雛雞的致病性明顯低于SM6。
　　三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA、四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB和SM6分別腹腔注射7日齡的SPF雞，分別于注射后的第2天、第4天、一直到第12天無(wú)菌采取雞的肝臟、脾臟和小腸，比較三個(gè)菌株在雞體不同組織的定植情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在注射后的第10

9、天在雞的肝臟、脾臟和小腸只能分離到比較少的沙門(mén)氏菌，均顯著低于(p＜0.05) SM6在肝臟、脾臟和小腸的分離情況。基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在雞體內(nèi)的定植情況均明顯低于野生株SM6。
　　(4)基因缺失株株對(duì)雛雞的免疫保護(hù)試驗(yàn)
　　通過(guò)對(duì)免疫途徑和免疫劑量的摸索，制定了最佳的免疫程序。將64只7日齡SPF雞共隨機(jī)分為4組，即試驗(yàn)Ⅰ組（SM6△cpxR/lon/

10、HilA組，免疫劑量為1×108 CFU/mL）、試驗(yàn)Ⅱ組（SM6△cpxR/lon/HilA/cpdB組，免疫劑量為1×109 CFU/mL）、試驗(yàn)Ⅲ組（滅活苗組）和對(duì)照組(PBS)，每組16只。肌肉注射，共免疫3次，每次免疫間隔兩周，一免后每周翅靜脈采血，分離血清，間接ELISA方法檢測(cè)血清IgG。每次免疫后2周用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化，于

11、第3次免疫后7天，以野生株SM6進(jìn)行攻菌。攻菌1周后，剖殺未死亡雞只，結(jié)合雞的存活率和內(nèi)臟病理變化，綜合評(píng)價(jià)基因缺失株的免疫保護(hù)效果。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB組和滅活苗組雞的血清抗體水平明顯高于三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA組，且各試驗(yàn)組抗體水平均高于對(duì)照組，四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB組和滅活苗組均能產(chǎn)生良好的體液免疫，且兩組差異不明

12、顯。各個(gè)免疫組外周血IL-2、IL-6、IFN-γ均呈上升趨勢(shì)，結(jié)合CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB疫苗和三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA疫苗均可以誘發(fā)良好的細(xì)胞免疫。攻菌后第7天，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在盲腸、肝臟和脾臟的荷菌數(shù)均低于三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA組和滅活苗組;從攻菌保護(hù)效果看，四基因