腸炎沙門氏菌菌毛編碼基因sefA和fimA的功能探析.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一種泛嗜性病原菌，寄生于人和動物腸道內，革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，大多數(shù)有鞭毛能運動。腸炎沙門氏菌不僅能引起畜禽疾病，還是重要的人類食源性致病菌。近年來，隨養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，腸炎沙門氏菌感染也越來越嚴重，其能夠引起肉雞生長遲緩，蛋雞產蛋量下降、死亡，造成了嚴重的經濟損失，且具有重要的公共衛(wèi)生學意義。菌毛是腸炎沙門氏菌致病過程中重要的毒力因子之一，其在體內體外均可表達多種菌毛結

2、構。Ⅰ型菌毛（SEF21菌毛）廣泛分布于沙門氏菌中，而SEF14菌毛特異性表達于腸炎沙門氏菌及相近的D-群沙門氏菌中，為探討上述兩種不同菌毛在腸炎沙門氏菌致病過程中的作用，本文以SEF14、SEF21菌毛為研究對象，利用腸炎沙門氏菌野生株50336和其SEF14、SEF21菌毛亞單位編碼基因缺失株及相應回補株，通過體外菌毛表達、上皮細胞系黏附性能、易感動物感染實驗綜合分析SEF14、SEF21菌毛功能，為腸炎沙門氏菌和宿主互作研究及防控

3、提供理論依據(jù)。
　　1不同培養(yǎng)條件下腸炎沙門氏菌菌毛表達情況
　　為進一步研究腸炎沙門氏菌SEF14菌毛的表達條件及SEF14、SEF21菌毛亞單位編碼基因對腸炎沙門氏菌中其他菌毛及鞭毛表達的影響，本試驗利用熒光定量RT-PCR方法檢測了37℃靜置、42℃靜置、菌毛誘導（37℃CFA中靜置60h）3種培養(yǎng)條件下腸炎沙門氏菌野生株50336中SEF14及SEF21菌毛表達情況，并檢測了SEF14及SEF21菌毛亞單位編碼基因單

4、缺失株50336△sefA、50336△fimA及雙基因缺失株50336△sefA△fimA中其他菌毛及鞭毛主要亞單位編碼基因的表達影響。試驗結果顯示:野生株50336在37℃CFA培養(yǎng)基靜置60h的菌毛誘導條件下SEF14菌毛主要亞單位編碼基因sefA表達量是對照條件（37℃靜置）的13.8倍，SEF21菌毛主要亞單位編碼基因fimA表達量和對照條件相當，42℃靜置條件下sefA、fimA表達量分別是對照組的5.8、6.1倍;單、雙缺

5、失株對其他菌毛及鞭毛的主要亞單位基因的表達影響結果顯示:誘導條件下，缺失株50336△sefA中fimA、afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的2.7、1.5、9.5倍，缺失株50336△fimA中sefA、afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的4.7、0.6、1.6倍，雙缺失株50336△sefA△fimA中afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的1.04、6.2倍;42℃靜置條件下缺失株50336△sefA中fimA

6、、afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的0.5、2.2、1.3倍，缺失株50336△fimA中sefA、afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的1.7、1.9、1.4倍，雙缺失株50336△sefA△fimA中afgA、fliC基因的表達量分別是野生株的3.6、2.2倍。上述結果表明在本研究中3種培養(yǎng)條件下SEF14、SEF21菌毛亞單位編碼基因單缺失株及雙基因缺失株對其他菌毛及鞭毛亞單位編碼基因均呈上調表達影響，這一結果意味

7、著不同的黏附因子（包括鞭毛）之間在不同培養(yǎng)體系中均呈現(xiàn)表達代償，某一黏附因子的缺失，其他黏附因子代償性表達提升，這一現(xiàn)象的具體機制有待于進一步研究。
　　2腸炎沙門氏菌SEF14、SEF21菌毛與腸上皮細胞IPEC-J2和Caco-2的體外黏附作用
　　為研究SEF14、SEF21菌毛對腸炎沙門氏菌致病過程中的影響，本實驗利用腸炎沙門氏菌野生株50336、單缺失株50336△sefA、50336△fimA、雙缺失株50336

8、△sefA△fimA、相應回補株50336△sefA（pBRA）、50336△fimA(pACYCF)和50336△sefA△fimA(pBRA+pACYCF)與不同的上皮細胞系（豬腸上皮細胞IPEC-J2及人結腸癌細胞Caco-2）進行其黏附性能的研究。試驗結果顯示:上述菌株均能與IPEC-J2及Caco-2細胞有效黏附，且細菌與細胞作用隨時間延長細菌黏附數(shù)量呈增多趨勢;在細菌和這兩種細胞系共同孵育1h和4h時，各菌株與IPEC-J2

9、細胞黏附數(shù)量是Caco-2細胞的2-4倍;在兩種細胞模型的黏附試驗中雙缺失株50336△sefA△fimA的黏附數(shù)量都明顯少于野生株，且在IPEC-J2試驗中1h、Caco-2試驗中4h時雙缺失株的黏附數(shù)量與野生株相比達到顯著水平，但是單缺失株50336△sefA、50336△fimA與細胞系的黏附數(shù)量隨較野生株有下降趨勢，均未達到顯著水平。本實驗結果表明腸炎沙門氏菌與腸上皮細胞的黏附作用盡管受某一特定因子如SEF14菌毛或者SEF21

10、菌毛的單一作用影響，雙缺失株對黏附性能的影響較大，說明多種菌毛結構或黏附因子之間可能存在協(xié)同作用;Caco-2細胞系和IPEC-J2細胞系作為研究沙門氏菌致病作用的主要細胞模型，但這兩種細胞系來源不同，且都是在塑料表面生長成單層來進行進一步實驗，腸道上皮的功能和特點不能完全模擬，可能展現(xiàn)與腸炎沙門氏菌的黏附作用的差異，腸炎沙門氏菌對IPEC-J2細胞系的黏附性比Caco-2細胞系強，且腸炎沙門氏菌與腸上皮細胞之間的作用是復雜的、多面的，

11、有待于更深入的研究。
　　3熒光定量RT-PCR檢測雛雞感染腸炎沙門氏菌后血液中TLR4、TLR15、NRAMP mRNA的表達
　　雞Toll樣受體4(TLR4)、Toll樣受體15(TLR15)、天然抗性相關巨噬細胞蛋白(naturalresistance-associated macrophage protein，NRAMP)在識別和抵抗病原微生物初始過程中發(fā)揮重要作用。為探索腸炎沙門氏菌SEF14、SEF21菌毛是否

12、參與腸炎沙門氏菌對易感宿主-雛雞的初始致病過程，本研究建立雛雞動物模型，檢測不同腸炎沙門氏菌標準株及相關菌毛突變株感染雛雞后血液中TLR4、TLR15、NRAMP mRNA的表達水平。結果顯示:在腸炎沙門氏菌感染后的不同感染進程中感染組與對照組相比血液中TLR4、TLR15、NRAMPmRNA表達量呈先上升后趨于一致的波動變化，表明雞TLR4、TLR15、NRAMP的基因表達與腸炎沙門氏菌感染密切相關;缺失株50336△fimA攻毒組攻

13、毒后1d時雛雞血液中TLR4及TLR15表達量上升，分別是野生株攻毒組的2.46和2.5倍，單缺失株50336△sefA及雙缺失株50336△sefA△fimA攻毒組與野生株組相比沒有明顯變化，表明SEF21菌毛影響腸炎沙門氏菌感染雛雞后血液中TLR4及TLR15表達;缺失株50336△fimA攻毒組雛雞血液中NRAMP基因表達量在攻毒后3d時達野生株組11.55倍，表明腸炎沙門氏菌SEF21菌毛的表達影響抗菌基因NRAMP的表達。其他