腸炎沙門氏菌SEF21和SEF14菌毛致病作用分析.pdf

1、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis，SE）是一類寄生于人和動物腸道內革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，絕大多數有鞭毛能運動。腸炎沙門氏菌不僅能夠引起肉雞生長遲緩，蛋雞產蛋量下降，死亡，造成嚴重的經濟損失，而且還會間接引起食用感染雞的蛋及肉制品的人食物中毒，是重要的人獸共患病原體，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。腸炎沙門氏菌的致病性與其毒力因子密切相關，這些毒力因子通過不同致病機制共同作用于宿主，引起宿主機體損害。菌毛是腸炎沙門氏菌

2、的重要毒力因子之一。腸炎沙門氏菌表達多種菌毛結構，在感染早期它能夠影響細菌對宿主靶組織的定植和粘附，也可以通過與宿主細胞表面的受體的特異性結合引起各種應答反應。腸炎沙門氏菌SEF21（Ⅰ型）菌毛廣泛分布于沙門氏菌屬，而SEF14菌毛特異性表達于腸炎沙門氏菌和都伯林沙門氏菌表面，本試驗以SEF21、SEF14菌毛為研究對象，構建SEF21菌毛亞單位缺失株及SEF21、SEF14菌毛亞單位雙缺失株，通過體外細胞試驗及易感動物感染試驗比較分析

3、SEF21菌毛與SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌感染過程中的作用，旨在揭示腸炎沙門氏菌與宿主相互作用的分子機制，為腸炎沙門氏菌的防控提供理論依據。
　　 1利用Red同源重組技術構建SEF21菌毛主要亞單位編碼基因缺失株
　　 根據GenBank中已經報道的S.enteritidisSEF21菌毛主要亞單位蛋白編碼基因fimA的序列，首先合成一對引物（每一條引物5'端與fimA基因同源，而3'端與pKD3質粒上氯霉素抗性基因

4、cat同源），經PCR擴增后得到具有氯霉素抗性基因和同源臂的產物，將PCR擴增產物直接轉化入腸炎沙門氏菌中，在pKD46表達的重組酶的作用下，PCR產物兩端的fimA基因同源序列與腸炎沙門氏菌染色體上的的同源序列發(fā)生同源重組交換，利用抗性篩選得到陽性一次重組菌。利用編碼Flp重組酶的質粒pCP20，去除氯霉素抗性基因，最后在染色體上只留下一個FRT位點，得到二次重組菌，通過PCR擴增及測序鑒定突變株的正確構建。本試驗成功構建了腸炎沙門氏

5、菌國內標準株50336、國際標準株994的fimA基因缺失株，并在實驗室保存的SEF14菌毛亞單位缺失株50336ΔsefA、994ΔsefA的基礎上構建了雙缺失突變株ΔsefAΔfimA2株。上述缺失株的成功構建，為進一步深入研究SEF21、SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌感染過程中的獨立或協同作用，及如何有效控制腸炎沙門氏菌污染禽蛋產品奠定了一定的基礎。
　　 2SEF21與SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌致病過程中作用初探

6、　　 為了進一步研究SEF21和SEF14菌毛對腸炎沙門氏菌致病性的影響，我們將表達sefA基因的pBR322質粒和表達fimA基因的pACYC184質粒轉化入相應的單基因或雙基因缺失株，構建了互補株。基于野生株50336、994，缺失株XΔsefA、XΔfimA、XΔsefAΔfimA及相應互補株的基礎上，分別進行了人結腸癌細胞系Caco-2的粘附作用，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗及腹腔巨噬細胞內存活試驗。各野生株、缺失株和相應回補株于

7、CFA培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)48-50h，使SEF21、SEF14菌毛充分表達，以感染復數為100的細菌懸液感染Caco-2細胞，細菌與細胞共孵育1h，試驗結果表明，XΔsefA、XΔfimA單缺失株與野生株在粘附數量上差異不顯著，但XΔsefAΔfimA雙缺失株的粘附數量則明顯下降。同等條件下進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗和存活試驗，選取感染1h和4h為時間點，試驗結果表明，隨著時間的增加，小鼠腹腔巨噬細胞對所有野生株、突變株和回補株的吞噬作

8、用加強，且對XΔfimA和XΔsefAΔfimA的吞噬作用尤為顯著，但與X△sefA不同，其在活化的小鼠腹腔巨噬細胞內的存活能力降低。上述結果可能意味著腸炎沙門氏菌與腸上皮細胞的粘附作用盡管受某一特定因子的單一作用影響，但需要多種菌毛結構或粘附因子的共同作用。SEF14菌毛與SEF21菌毛都可能影響腸炎沙門氏菌與巨噬細胞的相互作用，兩者的存在更有利于腸炎沙門氏菌侵入巨噬細胞并在巨噬細胞內生長繁殖，導致宿主隱性感染和長期排毒。
　　

9、 3腸炎沙門氏菌及其菌毛突變株對Balb/c小鼠的感染試驗將6周齡Balb/c小鼠分成一個對照組和7個攻毒組，經腹腔注射途徑分別對各攻毒組試驗小鼠接種10、102、103cfu劑量的腸炎沙門氏菌50336和突變株50336ΔsefA、50336ΔfimA、50336ΔsefAΔfimA及相應互補株，觀察攻毒后試驗組小鼠的臨床變化和死亡情況，對死亡小鼠進行細菌學鑒定。測定半數致死量結果顯示腸炎沙門氏菌50336和突變株50336Δsef

10、A、50336ΔfimA、50336ΔsefAΔfimA及相應互補株對6周齡Balb/c小鼠的LDs0分別為10.50cfu，8.06cfu，14.38cfu，16.77cfu，11.90cfu，11.90cfu，10cfu，說明SEF21菌毛與SEF14菌毛對腸炎沙門氏菌致病力的影響不一，突變株50336ΔsefA增強腸炎沙門氏菌對Balb/c小鼠的毒力，而突變株50336ΔfimA則減弱腸炎沙門氏菌毒力，雙突變株50336ΔsefA

11、ΔfimA毒力降低的原因可能是由于其對腸上皮細胞的粘附能力下降同時又易被巨噬細胞清除有關。腸炎沙門氏菌及其突變株感染小鼠后，細菌侵害多個臟器，分布廣泛，細菌鑒定結果表明，小鼠肝、腎、脾、肺、盲腸及小腸中都可成功分離到攻毒菌株。根據腸炎沙門氏菌以及相應菌毛突變株對Balb/c小鼠的感染試驗，進一步驗證了腸炎沙門氏菌不同菌毛結構對其致病性的影響，SEF21菌毛可能在腸炎沙門氏菌抵抗易感宿主巨噬細胞殺傷作用方面起到關鍵作用，而在SEF14菌毛