鴨致病性腸炎沙門氏菌外膜蛋白組成及免疫原性研究.pdf

1、本研究圍繞鴨致病性腸炎沙門氏菌外膜蛋白開展了以下研究：①鴨致病性腸炎沙門氏菌外膜蛋白超微結(jié)構(gòu)觀察和SDS-PAGE、免疫印跡分析；②將提取的外膜蛋白制成亞單位疫苗按一定劑量免疫雛鴨(OMPs150μg)和小鼠(OMPs30μg)，免疫后14d皮下注射腸炎沙門氏菌鴨0.2mL(4×109CFU/mL)活菌/只，小鼠0.2mL(1×107CFU/mL)活菌/只。觀察7d，記錄發(fā)病死亡情況，測定疫苗的保護(hù)率。③將提取的外膜蛋白制成亞單位疫苗按

2、一定劑量(OMPs150μg)免疫雛鴨，在免疫后的1d、7d、14d、21d、28d、35d、42d采抗凝血和凝血各一份。采用淋巴細(xì)胞增殖試驗(MTT法)及間接ELISA分別對雛鴨的細(xì)胞免疫和體液免疫進(jìn)行檢測。④將提取的外膜蛋白制成佐劑苗按一定劑量(OMPs30μg)免疫小鼠，全菌滅活佐劑苗0.2mL/只免疫小鼠，在免疫后1、4、7、10、14天采抗凝血和凝血分別用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(MTT法)及間接ELISA分別對小鼠的細(xì)胞免疫和體液

3、免疫的檢測。 獲得結(jié)果如下： 1.超微結(jié)構(gòu)：外膜蛋白負(fù)染后透射電鏡下3萬倍放大可以看到外膜蛋白呈雙層泡膜狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)主要呈C型。 2.SDS-PAGE分析：9株菌的外膜蛋白電泳圖非常相似，每個泳道上都含有主要4條主要的蛋白多肽，個別泳道上出現(xiàn)了5條或者6條蛋白帶。其中36kD為9株菌所共有且含量最高，是主要蛋白。 3.免疫印跡分析：9株菌的外膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE后進(jìn)行免疫印跡試驗，發(fā)現(xiàn)各菌株都有1條

4、分子量為36kD的蛋白多肽與抗鴨腸炎沙門氏菌陽性血清發(fā)生免疫反應(yīng)，呈現(xiàn)出陽性條帶。 4.外膜蛋白免疫攻毒保護(hù)實驗： 外膜蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨能夠抵抗致死量同源菌的攻擊，保護(hù)率100％；而空白對照組則全部死亡，剖檢具有典型病變。 外膜蛋白佐劑苗和全菌滅活苗免疫小鼠后，可以抵抗致死量同源菌的攻擊，外膜蛋白組保護(hù)率90％，滅活苗組保護(hù)率80％，對照組全部死亡。 5.體液免疫和細(xì)胞免疫檢測(1)外周血抗體lgG

5、水平： 雛鴨血清中特異性抗體OD值從免疫后第7d開始升高，第21d達(dá)到最大值(OD值達(dá)0.642)，以后開始下降，直到第42dOD值仍維持一定水平；從免疫后第7d始，直到第42d，免疫組抗體OD值均高于非免疫對照組差異極顯著(P＜0.01)。 小鼠免疫后經(jīng)過間接ELISA檢測可以看出，免疫組抗體OD值均高于非免疫對照組差異顯著(P＜0.05)，全菌滅活苗組抗體OD值低于外膜蛋白苗組，但兩種疫苗之間的差異不顯著(P＞0.0

6、5)。 (2)T淋巴細(xì)胞對ConA的反應(yīng)能力： 雛鴨免疫外膜蛋白后，從第14d開始外周血淋巴細(xì)胞對ConA的刺激有明顯的反應(yīng)，第21d時OD值達(dá)到最大值(0.500)，以后開始下降，第14-28d免疫組OD值均高于非免疫對照組異極顯著(P＜0.01)。 外膜蛋白免疫小鼠后外周血T淋巴細(xì)胞對ConA有明顯的反應(yīng)性，在第7d時，T淋巴細(xì)胞對ConA的反應(yīng)能力就明顯高于滅活苗組(P＜0.05)和空白對照組(P＜0.01