分子佐劑C3d對腸炎沙門氏菌Ⅰ型菌毛主要亞單位FimA免疫原性影響的研究.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis，SE)不僅能引起畜禽發(fā)病，也是人類食物中毒的主要病原之一，其廣泛流行不僅給社會造成了極大的經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅著人們的生命健康，是人類公共衛(wèi)生的一大隱患。研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌能夠粘附并侵入多種細胞，這種能力被認為是其產(chǎn)生致病性的主要原因，而菌毛作為細菌粘附并侵入宿主細胞的主要毒力因子，對其致病性有著至關(guān)重要的作用。腸炎沙門氏菌主要有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、SEF14和SEF

2、18等主要菌毛，其中大多數(shù)的腸炎沙門氏菌都表達Ⅰ型菌毛，F(xiàn)imA是Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位，其編碼基因方fimA。
　　 C3d是補體C3分子不能再被蛋白酶水解的最小片段，當C3d與抗原分子相連時，可以直接與抗原提呈細胞上的CR2受體結(jié)合，降低B淋巴細胞的活化閾，從而提高抗原分子的免疫原性。因此，C3d被認為是新型的分子佐劑，日益引起人們的關(guān)注。相繼有報道證實C3d分子的佐劑作用，但這些大都是基于真核載體表達蛋白和一些DNA疫苗的

3、研究，關(guān)于C3d分子對原核載體表達蛋白免疫原性的影響，目前還沒有相關(guān)報道。
　　 為探索C3d分子對原核載體表達蛋白免疫原性的影響，本研究選取腸炎沙門氏菌Ⅰ型菌毛的主要亞單位編碼基因fimA為目的基因，構(gòu)建pCold-fimA及含不同拷貝mC3d的pCold-fimA-mC3dn重組表達質(zhì)粒。主要構(gòu)建方法為：用PCR方法從腸炎沙門氏菌標準株SD-2染色體中擴增fimA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接T載體和序列測定，將驗證正確的目的

4、基因fimA插入表達載體pCold-TF，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-fimA，同時將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pUC-mC3d(單拷貝)、pUC-mC3d2(2拷貝)及pUC-mC3d3(3拷貝)進行限制性內(nèi)切酶消化，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收得到上述不同拷貝mC3d的基因片段mC3d、mC3d2及 mC3d3，將其分別插入已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCold-fimA上，獲得fimA串聯(lián)不同拷貝mC3d的重組質(zhì)粒

5、pCold-fimA-mC3d、pCold-fimA-mC3d2和pCold-fimA-mC3d3?；谏鲜鲋亟M質(zhì)粒構(gòu)建，通過IPTG15℃誘導(dǎo)24 h獲得高效表達的可溶性FimA蛋白和串聯(lián)不同拷貝mC3d的FimA-mC3dn融合蛋白，利用Novagen公司的固定化Ni2+親和層析試劑盒對重組蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，分別在70 kDa、100kDa、130 kDa和160 kDa處出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的特異性條帶。West

6、ern-blot結(jié)果顯示，腸炎沙門氏菌Ⅰ型菌毛的多抗均能識別上述重組蛋白，表明其具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　 為進一步探索C3d分子對FimA免疫原性的影響，將表達純化的可溶性FimA和FimA-mC3dn融合蛋白免疫BABL/c小鼠。免疫程序為：首免，分別用可溶性FimA、FimA-mC3d、FimA-mC3d2和FimA-mC3d3裸抗原進行免疫，每種蛋白分0.1μg、1μg和10μg3個免疫劑量組；間隔35 d進行

7、二免，均用弗氏不完全佐劑乳化的FimA免疫，免疫劑量為10μg。免疫過程中每周采血分離血清，通過間接ELISA檢測抗體效價的變化。二免1周之后，用腸炎沙門氏菌標準株SD-2對實驗小鼠進行攻毒，攻毒劑量為10 cfu，然后觀察各組小鼠的死亡情況。
　　 蛋白免疫實驗結(jié)果表明，當免疫劑量分別為0.1μg和1μg時，F(xiàn)imA免疫組和FimA-mC3dn免疫組之間抗FimA抗體效價無顯著差異。當免疫劑量為10μg時，與FimA免疫組相比

8、，F(xiàn)imA-mC3d2和FimA-mC3d3免疫組抗體效價分別提高了2倍和4倍；但FimA-mC3d與FimA的差別不明顯；當免疫劑量為10μg時，F(xiàn)imA-mC3d3的抗體效價比FimA-mC3d和FimA-mC3d2的抗體效價分別提高了4倍和2倍。攻毒保護實驗的結(jié)果表明，在免疫劑量為10μg時，F(xiàn)imA免疫組的保護率為50％(2/4)，而FimA-mC3d2和FimA-mC3d3免疫組的保護率分別為75％(3/4)和100％(4/4