沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白SipA導(dǎo)致腸炎的分子機(jī)制.pdf

1、沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，它可以引起自限性腸炎、傷寒等疾病。沙門氏菌的致病性主要與染色體上成簇分布的編碼致病相關(guān)基因的特定區(qū)域-致病島(Salmonellapathogenicity island，SPI)相關(guān)。目前，已在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)致病島，即SPI-1～SPI-5。其中SPI1和SPI2各自編碼不同的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，TTSS1(typeⅢ secretionsystem1)和TTSS2（typeⅢ secretion system

2、2）。其中SPI1-TTSS與細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞相關(guān)，而SPI2-TTSS在細(xì)菌的存活和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。
　　SipA是SPI1編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白之一，它可以與actin相互作用。促進(jìn)G-actin聚合成為F-actin;結(jié)合F-actin，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排從而促進(jìn)沙門氏菌入侵宿主細(xì)胞。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物感染模型中，SipA促進(jìn)腸炎的發(fā)生。但是，對于SipA導(dǎo)致腸炎的分子機(jī)制還不清楚。因此，本課題首先找到S

3、ipA與actin相互作用的具體位點(diǎn)，構(gòu)建SipA的突變菌株使其失去與actin的作用，然后利用動(dòng)物感染模型探討突變菌株對腸炎的影響，從而闡明SipA與actin相互作用的結(jié)構(gòu)域是否與其導(dǎo)致腸炎的功能相關(guān)。
　　已有研究結(jié)果表明SipA497-669是與actin相互作用的最小結(jié)構(gòu)域。在此基礎(chǔ)上，本研究首先構(gòu)建了一系列SipA的截短突變體，利用共沉的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證這些截短突變體的功能，從而找到SipA與actin相互作用的最小結(jié)構(gòu)域

4、。利用點(diǎn)突變試劑盒，構(gòu)建SipA的點(diǎn)突變體，利用共沉的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證這些點(diǎn)突變體的功能，從而找到SipA與actin相互作用的位點(diǎn)。研究結(jié)果表明SipA514-651是與actin相互作用的最小結(jié)構(gòu)域;SipA635位和637位氨基酸是與actin相互作用的氨基酸位點(diǎn)。同時(shí)利用pyrene-actin實(shí)驗(yàn)來研究SipA514-651, SipA635,637對actin聚合臨界濃度的影響，發(fā)現(xiàn)SipA514-651，SipA635,637

5、均可以降低G-actin聚合的臨界濃度，從而促進(jìn)G-actin的聚合。
　　為了進(jìn)一步研究SipA的功能，利用同源重組方法構(gòu)建了沙門氏菌染色體sipA點(diǎn)突變的突變菌株:包括sipAK551A S.Typhimurium, sipAK635A S.Typhimurium，sipAE637WS.Typhimurium，sipAK635AE637W S.Typhimurium，sipA1580SK581A S.Typhimurium。在

6、細(xì)胞水平，通過感染HeLa細(xì)胞研究這些突變菌株侵襲宿主細(xì)胞的能力是否發(fā)生改變。在動(dòng)物水平，利用小鼠的感染模型研究這些突變菌株是否可以導(dǎo)致嚴(yán)重的腸炎。研究結(jié)果表明，sipAK635AE637WS.Typhimurium的侵襲力明顯低于野生株;但是，sipAK635AE637WS.Typhimurium引起腸炎程度與野生株相似，也就是說把SipA與actin相互作用的氨基酸位點(diǎn)突變后并不影響其促進(jìn)腸炎的發(fā)生。以上研究豐富了SPI1-TTSS