廣東省2007-2013年腸炎沙門氏菌耐藥特征及分子分型研究.pdf

1、研究背景:
　　沙門菌是革蘭氏陰性桿菌，屬腸桿菌科，在自然界有廣泛宿主分布，存在于大多數(shù)動物及人的胃腸道中;也常常存在于水、蛋及蛋制品、肉類及其他食品中。根據(jù)O抗原（菌體抗原）及H抗原（鞭毛抗原）的抗原特性進行分類，沙門菌有2500多種血清型;其中鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌是人獸共患最常見的血清型?；颊吒腥境３霈F(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐等癥狀;沙門菌感染多為自限性疾病，患者可自愈，但敗血癥等并發(fā)癥需要抗生素治療。
　　沙門菌污染食品致

2、腹瀉暴發(fā)由以前的點源性集中暴發(fā)，越來越多地轉(zhuǎn)變?yōu)榭绲貐^(qū)跨州（?。┑纳⒃诒┌l(fā)形式出現(xiàn)，使污染源及傳播途徑的發(fā)現(xiàn)更需要分子分型手段的輔助及確認。分子水平上的分型方法一般包括三種:基于DNA序列多態(tài)性分析的分型方法、基于擴增特定基因產(chǎn)物的PCR分型方法、以及基于細菌DNA的限制性內(nèi)切酶分析的分型方法。
　　脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世紀80年代中期發(fā)展起來的用于分離

3、大分子量線性DNA分子的一種電泳技術(shù)，被譽為細菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標準”。其原理是在瓊脂糖凝膠上外加方向、時間與電流大小交替改變的脈沖電場，從而使得DNA分子得到有效地分離。通過比較DNA分子電泳圖譜來確認菌株之間的關(guān)聯(lián)。菌株間由于酶切位點突變、插入序列不同等原因會產(chǎn)生不同圖譜，一般認為電泳條帶差異越少則基因差異越小，菌株親緣關(guān)系則越近;反之則菌株間無相關(guān)性，但對親緣關(guān)系較遠的菌株分型效果不佳。PFGE適于研究一個暴發(fā)事件中，菌株

4、之間的來源關(guān)系。
　　多位點序列分型技術(shù)(multi-locus sequence typing，MLST)基于核酸序列測定技術(shù)，通過測定基因序列的變化反映菌株之間的進化關(guān)系，在推論菌株間遺傳進化關(guān)系和種群相關(guān)性等方面有其他分型方法無可比擬的優(yōu)勢。其具有每種細菌的等位基因信息可通過互聯(lián)網(wǎng)使其全球標準化，具有快速、實驗結(jié)果可比性高和分辨水平高等優(yōu)點。由于他們遺傳穩(wěn)定性，他們不能為短期的流行病學(xué)研究提供有力的幫助。故MLST適于研究在

5、一個大群體內(nèi)，一段時期內(nèi)，菌株之間的親緣關(guān)系。
　　本研究旨在對廣東地區(qū)開展腸炎沙門菌耐藥監(jiān)測和耐藥菌株的分子分型研究，對2007-2013年GSS的腸炎沙門菌臨床分離株進行藥物敏感性檢測（微量肉湯稀釋法），并針對目前臨床上治療沙門菌感染主要使用喹諾酮類藥物和頭孢類藥物，特別是Ⅱ代頭孢菌素類以及Ⅲ代喹諾酮類的耐藥菌株進行耐藥基因PMQR的檢測和PFGE、MLST分子分型，有利于我們對于臨床高頻用藥的監(jiān)測追蹤，將重點監(jiān)測結(jié)果及時反饋

6、，可以更好地指導(dǎo)臨床合理用藥。獲取的耐藥菌株的核酸指紋基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可以分析本省監(jiān)測點醫(yī)院腹瀉病例臨床分離株之間的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性，了解其分子遺傳特征，為發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌可能引起的暴發(fā)提供本底發(fā)病水平，為實驗室監(jiān)測、鑒定溯源及防控預(yù)警提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考，提高食源性疾病的檢測和防控能力。
　　研究目的:
　　1、了解2007年-2013年廣東省人群中感染腸炎沙門菌的耐藥情況，繪制耐藥譜，分析多重耐藥特點。為指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理選擇使用抗

7、生素，同時為預(yù)防和控制腸炎沙門菌引起的感染性腹瀉的發(fā)生和流行提供科學(xué)依據(jù)。
　　2、根據(jù)耐藥結(jié)果選擇耐氟喹諾酮類和頭孢類藥物的菌株進行PMQR基因檢測，了解耐藥基因在廣東省腸炎沙門菌中的分布，發(fā)現(xiàn)其流行病學(xué)規(guī)律。
　　3、對耐藥腸炎沙門菌菌株進行PFGE分型和MLST分型，對菌株帶型的聚集和分布規(guī)律進行分析，掌握廣東省流行株型別與全球流行現(xiàn)況，以發(fā)現(xiàn)帶型的流行病學(xué)規(guī)律，為監(jiān)測和暴發(fā)研究提供基礎(chǔ)。
　　研究方法:

8、　　1、采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法對廣東省2007-2013年腸炎沙門菌進行抗生素敏感性實驗，測定菌株的最小抑菌濃度（MIC值）。使用WHONET5.3進行抗生素敏感性試驗數(shù)據(jù)分析，并將數(shù)值導(dǎo)入SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，對2007-2013年GSS系統(tǒng)腸炎沙門菌的陽性檢出率狀況、三間分布特點，以及抗生素敏感性和多重耐藥的特點進行描述性統(tǒng)計分析。
　　2、對耐頭孢類和氟喹諾酮的菌株進行PMQR質(zhì)粒基因(qnrA、qnr

9、B、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、aac(6')-Ib-cr)檢測，分析介導(dǎo)腸炎沙門菌對氟喹諾酮耐藥的質(zhì)粒基因在廣東省的分布情況及其對MIC值的影響。MIC幾何均數(shù)值的組間比較采用變量變換后的非配對t檢驗，計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、參照國際PulseNet的沙門菌PFGE分子分型標準操作方案，對上述耐頭孢類和氟喹諾

10、酮類的腸炎沙門菌進行分子分型。菌株先經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，脈沖場凝膠電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)生成圖像條帶，BioNumerics軟件對圖像條帶進行識別、處理，H9812菌株作為標準分子量進行校準。選擇非加權(quán)配對算術(shù)平均法進行條帶的聚類分析，根據(jù)分析結(jié)果使用統(tǒng)一命名規(guī)則對條帶進行編號，建立耐藥腸炎沙門菌的PFGE分子分型數(shù)據(jù)庫。
　　4、參考PulseNet推薦的沙門菌7個位點(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、s

11、ucA、thrA) MLST標準操作方案，對反應(yīng)體系和檢測步驟進行相關(guān)的優(yōu)化，測序后根據(jù)分析結(jié)果使用既定命名規(guī)則對ST型別進行編號，建立數(shù)據(jù)庫。結(jié)合菌株的流行病學(xué)資料，對MLST型別的親緣進化關(guān)系、分布規(guī)律以及與耐藥譜的關(guān)系進行分析，同時與PFGE分型進行比較，綜合評價MLST的分型能力和實際應(yīng)用價值。
　　研究結(jié)果:
　　1、2007-2013年共收集散發(fā)腹瀉病例63687例，分離得到腸炎沙門菌菌株386例（檢出率6.06

12、％）。菌株分離主要來源于廣州、東莞，并以珠三角城市群為中心，呈散發(fā)趨勢，各地區(qū)檢出率無顯著性差異。在分離的386株散發(fā)病例腸炎沙門菌中，男女比例為1∶0.698;各個年齡段均有感染的可能性，總體以1～4歲的兒童病例為主，占總數(shù)的35.23％(136/386)，中青年組（18～60歲）病例排行第二，占總數(shù)的23.83％(92/386)。全年均可檢出，高峰期為6～10月。
　　2、MIC結(jié)果顯示，腸炎沙門菌對八種抗生素均可能產(chǎn)生耐藥。

13、喹諾酮類藥物中以第一代喹諾酮類藥物萘啶酸(NAL)耐藥率最高85.23％(329/386)，MIC50值為128μg/ml;以第二代頭孢菌素類的頭孢西丁耐藥率最低(0.52％，2/386)，MIC50值為2μg/ml，此外，四環(huán)素(TET)的耐藥率也較高(30.83％，119/386)，MIC50值為2μg/ml。386株菌共有27個耐藥譜，以單一耐萘啶酸(NAL)(43.78％，169/386)為主，其次耐四環(huán)素加萘啶酸(TET+NA

14、L)(15.03％,58/386)。有63株菌株對3種及3種以上的抗生素耐藥，占菌株總數(shù)的16.32％(63/386)。
　　3、根據(jù)MIC藥敏結(jié)果篩選出71株耐氟喹諾酮類藥物和耐頭孢類藥物的腸炎沙門菌的PMQR基因檢測結(jié)果為:總體質(zhì)粒攜帶率為63.38％(45/71)，其中35株僅攜帶一種PMQR基因(49.30％，35/71);9株攜帶兩種PMQR基因(12.68％，9/71);1株攜帶四種PMQR基因(1.41％，1/71)

15、。oqxAB檢出率最高，達40.85％(29/71)，其次為qnrC(9.86％，7/71)，qepA未檢出。攜帶PMQR質(zhì)粒與未攜帶PMQR質(zhì)粒的菌株在氯霉素(CHL)和磺胺類藥物(TMP/SMZ)的MIC幾何均數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)差異，攜帶PMQR質(zhì)粒組多重耐藥的比例(75.56％，34/45)高于未攜帶PMQR質(zhì)粒的菌株比例。
　　4、71株耐藥腸炎沙門菌XbaⅠ酶切的聚類分析可分為兩個大聚類，PFGE圖譜的相似值為56％-100％

16、，共分為PFGE-XbaⅠ1-35型。最大的型別有8株菌，最小的為1株。
　　5、71株耐藥腸炎沙門菌的MLST分型均為同一型別，等位基因序為aroC5、dnaN2、hemD3、hisD7、purE6、sucA6、thrA11;等位基因譜為ST11型，屬于eBG4型。這說明廣東省耐藥腸炎沙門菌的優(yōu)勢序列型均為ST11型。
　　結(jié)論:
　　1、腸炎沙門菌為廣東省第二大優(yōu)勢血清型，主要易感人群為1-4歲的幼兒，夏秋季高發(fā)，

17、病例集中分布于珠三角地區(qū)。藥敏結(jié)果顯示萘啶酸(NAL)耐藥率最高，多重耐藥率為16.32％。
　　2、對于耐藥菌株的PMQR質(zhì)?；驒z測結(jié)果說明攜帶PMQR質(zhì)粒的菌株對比未攜帶質(zhì)粒的菌株耐藥性更高，且更易發(fā)生多重耐藥現(xiàn)象。
　　3、MLST的分子分型結(jié)果表明，在沙門菌同一血清型內(nèi)各菌株看家基因堿基序列的高度保守，而PFGE則提示腸炎沙門菌的分化程度不高;對于腸炎沙門菌來說，MLST和PFGE的分辨力均較低，還需用其他分辨力更