禽源腸炎沙門氏菌PmrB基因突變介導(dǎo)粘菌素耐藥機(jī)制研究.pdf

1、禽源腸炎沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌，可以通過食源性途徑傳染給人類。粘菌素（colistin）是一種常見的多肽類抗生素，目前是用于治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染最后的選擇。耐粘菌素腸炎沙門氏菌的出現(xiàn)及傳播給多重耐藥革蘭氏陰性菌的治療帶來了極大的威脅。有研究表明 PmrA/PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)對(duì)革蘭氏陰性菌粘菌素耐藥的產(chǎn)生起到重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室成功誘導(dǎo)出耐粘菌素腸炎沙門氏菌，對(duì)其PmrA、PmrB基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PmrB發(fā)生了不同

2、于已有報(bào)道的突變，PmrA基因并無變化。本研究在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上利用Red同源重組及I-Sce?酶構(gòu)建相應(yīng)的PmrB無痕突變菌株，研究突變前后菌株對(duì)粘菌素最小抑菌濃度（MIC），和粘菌素耐藥相關(guān)基因表達(dá)量變化，有助于了解禽源腸炎沙門氏菌 PmrA/PmrB突變對(duì)粘菌素耐藥的機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　利用粘菌素在2-12（32）菌株的基礎(chǔ)上繼續(xù)誘導(dǎo)耐藥，獲得2-12（512），利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2-12和2-12（512

3、）菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。2-12和2-12（512）全基因組測(cè)序后進(jìn)行同源分析得2-12有5個(gè)特有蛋白，2-12（512）有9個(gè)特有蛋白；單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析得2-12（512）與2-12比較有30個(gè)SNP位點(diǎn)。
　　在輔助質(zhì)粒pKD46-rha-IS表達(dá)的Red同源重組系統(tǒng)及I-Sce?酶的作用下，利用基因突變重組片段197-cat-sacB、249-cat-sacB無痕且快速對(duì)腸炎沙門氏菌PmrB基因進(jìn)行突變，成功獲得

4、了沙門氏菌PmrB基因突變株。
　　測(cè)定構(gòu)建的PmrB基因缺失及點(diǎn)突變菌株對(duì)多種抗菌藥物（包括粘菌素）的MIC值，結(jié)果表明，突變后菌株對(duì)粘菌素的MIC值均為16μg/mL，是2-12敏感菌株粘菌素 MIC的8倍。2-12ΔPIA與敏感菌相比對(duì)十二種常見抗生素敏感性無明顯變化；2-12D149N和2-12相比，慶大霉素（GM）MIC值提高160倍，大觀霉素（SPT）MIC值降低64倍，其余抗生素?zé)o明顯變化。
　　通過實(shí)時(shí)熒光定