動(dòng)物源沙門氏菌耐藥基因及毒力島基因mgtC和sopB的檢測(cè).pdf

1、沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的致病菌,它能引起人以及動(dòng)物疾病。通過流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告表明,沙門氏菌含有的毒力島基因與沙門氏菌病有非常緊密的聯(lián)系。毒力島相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn),對(duì)疾病的控制和預(yù)防,理解細(xì)菌性疾病的發(fā)生和發(fā)展具有很深遠(yuǎn)的意義。
　　本課題是利用PCR(PolymeraseChainReation)技術(shù),按照致病性動(dòng)物源性沙門氏菌的耐藥基因和毒力島特異性基因來設(shè)計(jì)引物,通過優(yōu)化擴(kuò)增條件和引物組合的配對(duì),得到了致病性畜

2、禽沙門氏菌耐藥基因PCR檢測(cè)方法以及毒力島基因雙重PCR方法。運(yùn)用建立的方法對(duì)豬源沙門氏菌進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,旨在為人畜共患沙門氏菌病的控制和預(yù)防提供了充分的理論基礎(chǔ)。
　　具體的研究方法及研究的結(jié)果如下:
　　1、動(dòng)物源性沙門氏菌四種耐藥基因的PCR檢測(cè)
　　該研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離保存到的24株畜禽沙門氏菌株(雞源10株、豬源14株)進(jìn)行了藥敏試驗(yàn),并設(shè)計(jì)6對(duì)引物,對(duì)氨基糖苷類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和氯霉素類四大類

3、藥物的耐藥基因進(jìn)行了擴(kuò)增,建立了耐藥基因的PCR檢測(cè)方法,最后對(duì)畜禽沙門氏菌的耐藥基因和耐藥性進(jìn)行了對(duì)比,藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明:20株試驗(yàn)菌株對(duì)2種以上抗菌藥物耐藥,多重耐藥率為83.3％,其中2耐5株(25%),4耐7株(35%),5耐5株(25%),7耐2株(10%),8耐1株(5%)。耐藥基因PCR檢測(cè)表明:tetA和tetB基因的擴(kuò)增率對(duì)四環(huán)素類藥敏實(shí)驗(yàn)相一致。blaTEM基因的擴(kuò)增率對(duì)氨芐西林和頭孢氨芐的藥敏實(shí)驗(yàn)相一致。對(duì)氨基糖苷

4、類耐藥的菌株中aac(3)-Ⅰ和aph(3)-Ⅱ擴(kuò)增率與菌株對(duì)慶大霉素、鏈霉素和新霉素的藥敏實(shí)驗(yàn)相一致。但是氯霉素類耐藥菌株中耐藥基因catI檢出率與菌株對(duì)氟苯尼考的和氯霉素的耐藥性結(jié)果相關(guān)性不顯著。
　　2、動(dòng)物源性沙門氏菌毒力島基因mgtC和sopB的PCR的檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)以沙門氏菌毒力島基因?yàn)檠芯繉?duì)象,根據(jù)GenBank發(fā)表的沙門氏菌毒力島基因序列,分別設(shè)計(jì)合成了沙門氏菌毒力島mgtC和sopB的兩對(duì)引物。以沙門氏菌(

5、ATCC9150)菌株的核酸為模板,經(jīng)過引物特異性試驗(yàn),DNA模板靈敏度試驗(yàn),優(yōu)化反應(yīng)條件,成功的建立了快速鑒別以及檢測(cè)沙門氏菌的雙重PCR方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明,引物mgtC和sopB建立的雙重PCR僅能擴(kuò)增出沙門氏菌(ATCC9150)的兩段特異性片段,大小分別是500bp和1000bp。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,檢測(cè)到的最低濃度是10CFU/mL。
　　此方法能夠?qū)卸玖虻男笄萆抽T氏菌進(jìn)行檢驗(yàn),也能夠?qū)χ虏⌒陨抽T氏菌進(jìn)行快

6、速的檢測(cè)。
　　3、沙門氏菌毒力島雙重PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用
　　本研究挑取臨床分離的9豬源沙門氏菌,然后對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)用已經(jīng)建立好的毒力島雙重PCR方法。研究說明:在9株豬源性沙門氏菌分離株中,有8株菌株被檢測(cè)出mgtC基因,此方法的檢測(cè)率為88.9%,同樣也有8株被檢測(cè)出了sopB基因,檢出率為88.9%。通過檢測(cè)結(jié)果顯示:本研究所建立起來的雙重PCR檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng),該方法對(duì)沙門氏菌的快速診斷和對(duì)分子流行病學(xué)調(diào)查