鼠傷寒沙門氏菌rfbN基因突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、鼠傷寒沙門氏菌rfbN基因編碼的蛋白為合成O-抗原的鼠李糖轉(zhuǎn)移酶，它負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鼠李糖。我們構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌rfbN基因缺失株以及阿拉伯糖調(diào)控rfbN基因表達(dá)的突變株，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，主要內(nèi)容可歸納如下:
　　1、鼠傷寒沙門氏菌rfbN基因缺失株的構(gòu)建
　　鼠傷寒沙門氏菌rfbN基因大小945bp，我們構(gòu)建了重組自殺性質(zhì)粒pYA4286-ΔrfbN，利用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法，構(gòu)建了rfbN基因缺失株。

2、LPS圖譜顯示，ΔrfbN缺失株沒有完整的LPS，其LPS結(jié)構(gòu)包括類脂A、核心多糖和一個半乳糖。我們構(gòu)建了15a-rfbN回補(bǔ)質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)化入ΔrfbN缺失株，LPS圖譜顯示，15a-rfbN回補(bǔ)質(zhì)粒能夠恢復(fù)ΔrfbN缺失株的LPS結(jié)構(gòu)，表明成功構(gòu)建rfbN基因缺失株。
　　2、鼠傷寒沙門氏菌阿拉伯糖調(diào)控rfbN基因突變株的構(gòu)建
　　我們通過改造rfbN基因的SD序列和起始密碼子，構(gòu)建了重組自殺性質(zhì)粒pYA4286-Δpa

3、gL-TT araC PBADrfbN，利用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法，構(gòu)建了兩株阿拉伯糖調(diào)控rfbN基因表達(dá)的突變株:ΔrfbNΔpagL∷TT araC PBADrfbN(起始密碼子ATG)和ΔrfbNΔpagL∷TT araC PBADrfbN（起始密碼子GTG）。在有阿拉伯糖存在條件下，ΔrfbNΔpagL∷TT araC PBADrfbN(起始密碼子ATG)突變株，調(diào)控表達(dá)rfbN基因，使細(xì)菌能夠合成完整的LPS;而沒有阿拉

4、伯糖的條件下，rfbN基因不表達(dá)，其LPS表型與ΔrfbN株相同。然而，在有阿拉伯糖存在條件下，ΔrfbNΔpagL∷TT araC PBADrfbN（起始密碼子GTG）突變株，rfbN基因少量表達(dá)，細(xì)菌沒有完全恢復(fù)LPS結(jié)構(gòu)。
　　3、鼠傷寒沙門氏菌突變株生物學(xué)特性研究
　　為了解析rfbN基因?qū)κ髠抽T氏菌生物學(xué)特性的影響，我們系統(tǒng)地比較了突變株與野生株在生長曲線、泳動與群集、對多粘菌素B的抵抗力、粘附與入侵及毒力這幾

5、個方面的差異。結(jié)果表明，ΔrfbN缺失株與ΔrfbNΔpagL∷TT araCPBADrfbN（起始密碼子ATG）突變株在體外生長曲線、細(xì)胞粘附率、細(xì)胞入侵率與野生株無顯著性差異。相比之下，rfbN基因缺失后，菌株的泳動和群集能力顯著下降(P＜0.001)，在多粘菌素B作用下的存活率顯著下降(P＜0.001)，毒力下降。同時，在阿拉伯糖存在條件下，ΔrfbNΔpagL∷TT araC PBADrfbN（起始密碼子ATG）突變株的泳動和群