豬霍亂沙門氏菌C78-1株Δcrp缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella Choleraesuis)是引起仔豬副傷寒的主要病原之一，可引起斷奶仔豬大批發(fā)病，常因伴發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時而大批死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。動物生前感染或食品受到污染，可使人發(fā)生食物中毒，在公共衛(wèi)生上也具有十分重要意義。疫苗接種是防控仔豬副傷寒的最適宜策略。在我國，研制仔豬副傷寒活疫苗比較成功的是有關(guān)專家將抗原性良好的豬霍亂沙門氏菌強毒株C78-1接種含有醋酸鉈的培養(yǎng)基中傳數(shù)百代后，選

2、出了免疫原性良好的弱毒株C500。但該菌株是經(jīng)化學(xué)方法傳代致弱，對其致弱的遺傳背景和引起免疫保護(hù)的機理目前仍不清楚。另外，該疫苗菌株具有一定的殘余毒力，且存在毒力返強的風(fēng)險。
　　 本研究旨在研制更加安全有效的豬霍亂沙門氏菌疫苗弱毒株，并為進(jìn)一步將其開發(fā)為適于粘膜免疫的口服疫苗活載體奠定一定基礎(chǔ)，以crp(cAMP receptor protein，crp)基因作為豬霍亂沙門氏菌C78-1株減毒基因，運用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌的

3、等位交換技術(shù)兩步法篩選豬霍亂沙門氏菌C78-1株 crp基因工程缺失突變株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。主要內(nèi)容包括：
　　 1．Crp基因的克隆與序列分析
　　 參照鼠傷寒沙門氏菌LT2株(GenBank No：AE008859)crp基因序列，從豬霍亂沙門氏菌C78-1基因組中擴增出crp基因。通過測序和序列對比分析顯示，與C500株crp基因全序列完全相同，與Genbank上登錄的其它全序列已知的3株沙門氏菌c

4、rp基因高度保守。
　　 2．重組自殺性質(zhì)粒pREΔcrp的構(gòu)建
　　 以豬霍亂沙門氏菌C78-1基因組為模板，分別擴增crp上下游片段并將其克隆入自殺性質(zhì)粒pRE112上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌χ7213，構(gòu)建含缺失320bp的crp基因重組自殺性質(zhì)粒pREΔcrp。
　　 3．接合轉(zhuǎn)移與缺失菌株ΔcrpC78-1的篩選鑒定
　　 以轉(zhuǎn)化了重組自殺性質(zhì)粒pREΔcrp的大腸桿菌χ7213為供體菌，C78-1為受體

5、菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。利用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌基因等位交換技術(shù)兩步法篩選crp基因缺失突變株，并進(jìn)行PCR和測序鑒定，以確定缺失菌株ΔcrpC78-1的構(gòu)建成功。
　　 4．缺失菌株ΔcrpC78-1生物學(xué)特性研究
　　 對缺失菌株ΔcrpC78-1表型、遺傳穩(wěn)定性、生長特性及對小鼠的毒力等生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：缺失菌株?crpC78-1失去了利用麥芽糖、蔗糖、果糖與甘露醇等碳源的能力，不能分解H2S，但保留了利用