沙門氏菌分離鑒定、生物被膜形成相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、禽沙門氏菌病是由沙門氏菌屬一個或多個成員所引起的急性或慢性傳染病，臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎等。沙門氏菌可以形成生物被膜，生物被膜的形成增加了細(xì)菌對不利條件的抵抗力，是細(xì)菌持續(xù)感染和反復(fù)感染的重要原因。本研究對動物源性沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定，測定其血清型、生物被膜形成能力和耐藥性;采用Red同源重組法構(gòu)建了與雞白痢沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因的缺失株，并且初步探討了生物被膜與致病性的關(guān)系，為進(jìn)一步研究沙門氏菌生物被膜在致病過程中的作用提供

2、了實驗依據(jù)。
　　 1.動物源性沙門氏菌的血清型、生物被膜形成能力和耐藥性分析
　　 從不同動物病料中分離細(xì)菌，以PCR方法鑒定沙門氏菌，結(jié)合玻片凝集法和16SrRNA序列測定確定沙門氏菌的血清型和分布，結(jié)晶紫染色定量法檢測分離株的生物被膜形成能力，藥敏試驗檢測分離菌對常用藥物的敏感性。結(jié)果顯示，共分離鑒定出58株沙門氏菌，主要包括雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、都柏

3、林沙門氏菌和阿哥那沙門氏菌7種血清型，其中雞群以雞白痢沙門氏菌感染為主，腸炎沙門氏菌次之;水禽以鼠傷寒沙門氏菌感染為主。生物被膜測定結(jié)果顯示51.72％的沙門氏菌分離株可形成生物被膜，其中鼠傷寒沙門氏菌83.33％可形成生物被膜。19種抗生素(氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、林可酰胺類、氯霉素類、青霉素類、四環(huán)素類和頭孢菌素類)敏感性試驗表明所有菌株對林可霉素耐藥，51.72％對4種及其以上抗生素耐藥，并出現(xiàn)了對所有受試抗生素均耐藥的鼠傷

4、寒沙門氏菌。因此，雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是目前在家禽中流行的優(yōu)勢血清型;具有生物被膜形成能力和多重耐藥性的沙門氏菌將對家禽疾病控制和公共衛(wèi)生帶來更大的威脅。
　　 2.雞白痢沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建
　　 以一株生物被膜形成能力強(qiáng)的雞白痢沙門氏菌S6702為母本，采用Red同源重組法構(gòu)建csgA、csgD、adrA和bcsA4個基因的缺失突變株，PCR、RT-PCR和回復(fù)試驗鑒定證明

5、4個基因缺失株構(gòu)建成功。生長曲線測定顯示，4個基因缺失株與野生株生長速度一致。96孔板結(jié)晶紫染色法測定缺失株的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示只有△csgA和△csgD缺失突變株完全不能形成生物被膜，而△adrA和△bcsA缺失突變株與野生株生物被膜形成能力相似。測定細(xì)菌在4種不同培養(yǎng)基中的生物被膜形成能力，結(jié)果表明野生型細(xì)菌及△adrA和△bcsA在TSB培養(yǎng)基中有更強(qiáng)的生物被膜形成能力。上述結(jié)果表明，雞白痢沙門氏菌生物被膜的形成與卷曲菌毛

6、蛋白調(diào)控基因csgA和csgD有關(guān)，而與纖維素的調(diào)控基因adrA和bcsA無關(guān)。
　　 3.雞白痢沙門氏菌生物被膜的致病作用
　　 選擇野生株和△csgA、△csgD、△adrA、△bcsA缺失突變株進(jìn)行Hela細(xì)胞的黏附和侵入試驗以及巨噬細(xì)胞內(nèi)增值試驗，結(jié)果顯示各缺失株與野生株沒有顯著的差異;1日齡SPF雞腹腔接種攻毒試驗表明，△csgD的LD50略低于野生株，而△bcsA的LD50略高于野生株，其它突變株與野生株毒力

7、類似。細(xì)菌體內(nèi)分布試驗表明，在腹腔攻毒6h后，△csgD組的脾臟中細(xì)菌數(shù)顯著增多，48h后，△bcsA組的膽汁中細(xì)菌數(shù)顯著降低，其它組別與野生株無顯著差異。細(xì)菌持續(xù)性感染試驗表明，雞白痢沙門氏菌至少可以在體內(nèi)存留8-9周，多存在于膽汁中，且能形成生物被膜的突變株△adrA和△bcsA感染組中的細(xì)菌檢測頻率高于不能形成生物被膜的突變株△csgA和△csgD感染組。上述結(jié)果顯示，生物被膜與細(xì)菌急性感染的致病性無直接關(guān)系;生物被膜可能與細(xì)菌的