沙門菌生物被膜形成調(diào)控基因rpoE的鑒定及缺失突變株的生物學(xué)特性研究.pdf

1、沙門菌能夠引起人和動(dòng)物的感染，是一種常見的人獸共患病原體。在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類健康，同時(shí)也給畜牧業(yè)及食品加工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。沙門菌能夠形成生物被膜，生物被膜的形成使細(xì)菌對外界環(huán)境的抵抗力增強(qiáng)，從而不易被消毒劑和抗生素清除，導(dǎo)致細(xì)菌的持續(xù)感染和反復(fù)感染。沙門菌生物被膜形成主要是由RpoS蛋白調(diào)控的，但也存在RpoS蛋白非依賴型生物被膜形成株。本研究利用結(jié)晶紫染色定量法測定120株沙門菌分離株的生物被膜形成能力;通過觸

2、酶試驗(yàn)測定RpoS蛋白活性，確定rpoS基因依賴型和非依賴型生物被膜形成株;利用建立的熒光定量PCR方法比較rpoS基因依賴型和非依賴型生物被膜形成株在指數(shù)期和生物被膜形成期不同Sigma因子的基因表達(dá)差異;運(yùn)用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建rpoE基因缺失株，并測定了缺失株的生物被膜形成能力和致病性，為進(jìn)一步闡明沙門菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　1.沙門菌生物被膜形成相關(guān)Sigma因子的鑒定
　　利用結(jié)晶紫染色定量法對

3、120株不同來源的沙門菌進(jìn)行生物被膜形成能力測定，通過接種于剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板、熒光增白劑平板測定生物被膜成分，觸酶試驗(yàn)測定生物被膜形成株的RpoS蛋白活性，最后利用建立的熒光定量PCR方法對6個(gè)Sigma因子在指數(shù)期和生物被膜形成期的基因表達(dá)量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，沙氏菌能在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上生長出四種菌落形態(tài)，分別是紅色干燥粗糙型、棕色干燥粗糙型、粉色干燥粗糙型和白色光滑型菌落。熒光增白劑平板在紫外線下的熒光強(qiáng)度與生物被膜中

4、纖維素的含量成正比。75％的沙門菌能夠形成生物被膜，其中rpoS基因非依賴型生物被膜形成株11株，rpoS基因依賴型生物被膜形成株79株。構(gòu)建6個(gè)Sigma因子的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用絕對定量繪制出6個(gè)Sigma因子的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取3株代表株檢測4-24h不同Sigma因子的基因表達(dá)量，結(jié)果顯示rpoS基因非依賴型生物被膜形成株在24 h生物被膜形成時(shí)期rpoE基因的表達(dá)量顯著高于其他5個(gè)Sigma因子。說明rpoE基因可能為rpoS

5、基因非依賴生物被膜形成株中參與生物被膜形成的Sigma因子。
　　2.沙門菌生物被膜形成相關(guān)Sigma因子缺失突變株的構(gòu)建
　　選取兩株rpoS基因非依賴型生物被膜形成株雞白痢沙門菌S6702和鼠傷寒沙門菌S016，以及一株rpoS基因依賴型生物被膜形成株鼠傷寒沙門菌S025。采用Red同源重組法分別構(gòu)建rpoS和rpoE基因的缺失突變株，利用PCR、RT-PCR和回復(fù)試驗(yàn)鑒定證明6個(gè)基因缺失突變株構(gòu)建成功。生長曲線測定顯示

6、，rpoS基因缺失株與野生株的生長速度無明顯差異;在雞白痢沙門菌S6702中，rpoE基因缺失株的生長速度高于野生株，而在鼠傷寒沙門菌S016和S025中，rpoE基因缺失株的生長速度低于野生株。結(jié)晶紫染色定量法測定缺失株的生物被膜形成能力結(jié)果顯示，在rpoS基因依賴株S025中，rpoS基因缺失后不能形成生物被膜;在非依賴株S6702和S016中，rpoS基因缺失后仍能形成生物被膜。rpoE基因缺失后均不能形成生物被膜?；貜?fù)試驗(yàn)結(jié)果顯

7、示，rpoS回復(fù)株與rpoE回復(fù)株和野生株的生物被膜形成能力類似。由此證明，rpoE基因?yàn)閰⑴c生物被膜形成新的Sigma因子。
　　3.沙門菌rpoE基因缺失株的致病性研究
　　對3株野生株S6702、S016、S025和6株基因缺失株(S6702△rpoE、S6702△rpoS、S016△rpoE、S016△rpoS、S025△rpoE、S025△rpoS)進(jìn)行HeLa細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)以及HD11巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)。試

8、驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株△rpoS與野生株差異不顯著;在鼠傷寒沙門菌中缺失株△rpoE與野生株相比黏附率、侵入率和增值率均有所降低，而在雞白痢沙門菌中缺失株△rpoE的黏附率、侵入率和內(nèi)增殖率均有所升高。1日齡SPF雞致死性試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株△rpoS的LD50均與野生株相似。在雞白痢沙門菌S6702株中，缺失株△rpoE的LD50有所下降;但在鼠傷寒沙門菌S016、S025株中，缺失株△rpoE的LD50均有所上升。細(xì)菌體內(nèi)分布試驗(yàn)結(jié)果表