沙門菌生物膜形成的影響因素及機制研究.pdf

1、第一部分鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對細菌生物膜形成的影響
　　目的：
　　鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）在多種物體表面形成的生物膜（Biofilm，BF）對增強其致病性有重要作用。本研究探討鼠傷寒沙門菌SR-11攜帶的100kb質(zhì)粒對細菌在不同材質(zhì)表面BF形成的影響，為后續(xù)進一步探討該質(zhì)粒的致病機制及抗菌藥物的研制提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.BF形成適

2、宜培養(yǎng)基的選擇
　　以攜帶質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌野生株SR-11為受試菌，將對數(shù)生長期菌液分別接種于含肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptose Soya Broth，TSB）的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板及置小圓玻片于底部的24孔培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)6h、12h、24 h和48h后用結(jié)晶紫半定量法比較在聚苯乙烯培養(yǎng)板與玻片表面BF形成的適宜培養(yǎng)基。
　　2.帶有綠色熒光蛋白GFP菌株的構(gòu)建及

3、生長曲線的測定
　　參照文獻將GFP基因?qū)霐y帶100kb質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌野生株SR-11和將該質(zhì)粒消除后的突變株，構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白GFP標記的發(fā)光菌。將對數(shù)生長期菌液稀釋后涂布于含100μg/ml氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，熒光顯微鏡下觀察。用構(gòu)建的野生株與突變株單克隆分別接種于LB培養(yǎng)基后測定細菌生長曲線。
　　3.鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對細菌在不同材質(zhì)表面BF形成的影響
　　按上

4、述條件，將野生株和突變株分別在聚苯乙烯培養(yǎng)板與玻片表面建立BF模型。結(jié)晶紫半定量法比較受試菌6h、12h、24h和48h在兩種材質(zhì)表面BF形成的差異；共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）斷層掃描，比較受試菌在玻片表面BF的形成。
　　結(jié)果：
　　1.BF形成適宜培養(yǎng)基的選擇
　　結(jié)晶紫半定量法結(jié)果顯示，野生株在聚苯乙烯培養(yǎng)板和玻片兩種材質(zhì)表面用LB培養(yǎng)基

5、各時間點的OD590值均高于TSB培養(yǎng)基，說明LB培養(yǎng)基更適宜BF的形成，在后續(xù)實驗中即選擇LB培養(yǎng)基。
　　2.帶有綠色熒光蛋白GFP菌株的構(gòu)建及生長曲線的測定
　　熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，用Amp選擇培養(yǎng)基能篩選出表達GFP的野生株與突變株。與未導入GFP基因的菌株相比，細菌生長曲線未受明顯影響。
　　3.鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對細菌在不同材質(zhì)表面BF形成的影響
　　結(jié)晶紫半定量法結(jié)果顯示，6h、12h、24h和4

6、8h聚苯乙烯培養(yǎng)板表面生長的野生株與突變株OD590值均未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）；在玻片表面生長的野生株OD590值各時間點均高于突變株（P<0.01）；野生株和突變株更易在聚苯乙烯培養(yǎng)板表面形成BF。CLSM觀察結(jié)果顯示，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后，野生株在玻片表面可形成融合成片的菌膜，平均厚度和最大厚度分別是25μm與30μm；突變株僅形成稀疏的菌落，平均厚度和最大厚度分別為15μm與18μm。
　　結(jié)論：
　　鼠傷寒

7、沙門菌SR-11攜帶的100kb質(zhì)粒能促進宿主菌在玻片表面BF的形成，但對聚苯乙烯培養(yǎng)板表面BF的形成未見明顯影響，說明BF的形成除與細菌的胞外黏附成份相關(guān)外還與其生成的材質(zhì)表面結(jié)構(gòu)相關(guān)。
　　第二部分胞外DNA對沙門菌生物膜形成的影響及其機制研究
　　目的：
　　通過檢測鼠傷寒沙門菌SR-11與傷寒沙門菌ST6生物膜（Biofilm，BF）胞外DNA（Extracellular DNA，eDNA）的含量及來源，研究其

8、在細菌BF形成和維持BF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用，為后續(xù)防治沙門菌感染、抗菌藥物和消毒劑的研制提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.BF中eDNA的檢測
　　(1)eDNA的分子量測定和定量分析
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種于含LB肉湯的聚苯乙烯6孔板，30℃靜態(tài)培養(yǎng)，于6h、12h、24h和48h用細胞刮刀收集BF樣本，分別用蛋白酶K和纖維素酶消化提取eDNA，瓊脂糖凝膠電泳法測定eDNA的分子量

9、并用紫外分光光度計對eDNA進行定量分析。
　　(2)CLSM觀察eDNA在BF中的定位
　　將對數(shù)生長期的SR-11與ST6菌液接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48 h。DDAO[7-hydroxy-9H-(1，3-dichloro-9，9-dimethylacridin)，DDAO]染色后用CLSM觀察熒光顏色的變化以確定eDNA在BF中的定位。
　　2.eDNA對細菌BF形

10、成及三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用
　　(1)微量平板法
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板中，同時加入終濃度為50μg/ml的DNase I，另設(shè)未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。結(jié)晶紫半定量法分別在6h、12h、24h和48h各時間點檢測DNase I對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板中，并加入用前

11、法提取的分別來自各菌的eDNA（終濃度5μg/ml），另設(shè)未加eDNA作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。結(jié)晶紫半定量法分別在6h、12h、24h和48h各時間點檢測eDNA對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB液體培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔板中，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，另設(shè)未加DNase I作陰性對照。用結(jié)晶紫半定量法檢測DNase I對BF結(jié)構(gòu)完整性的影響。

12、　　(2)CLSM觀察法
　　將對數(shù)生長期的帶有綠色熒光蛋白GFP標記的SR-11和ST6菌液分別接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，并加入50μg/ml DNase I，另設(shè)未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后CLSM觀察DNase I對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的帶有GFP標記的SR-11和ST6菌液接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48

13、h后加入50μg/ml DNase I，另設(shè)未加DNase I作陰性對照，CLSM觀察DNase I對受試菌BF三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用。
　　(3)DNase I對BF中活菌數(shù)的影響
　　將稀釋至OD600為0.05的SR-11和ST6菌液接種于6孔板中。實驗組加入50μg/ml DNase I，另設(shè)未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。分別將菌液和形成于管壁的菌膜用梯度稀釋平板菌落計數(shù)法對游離狀態(tài)和固著狀態(tài)的細菌

14、進行計數(shù)，觀察DNase I對兩種狀態(tài)下細菌生長的影響。
　　3.RAPD-PCR檢測eDNA的來源
　　用隨機擴增多態(tài)DNA聚合酶鏈式反應(yīng)（Random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）分析eDNA的來源。用酚氯仿法提取細菌基因組DNA，用兩種引物（P1254：5’-CCGCAGCCAA-3’，23L：5’-CCGCAGCCAA-3’）分別對SR-11和ST6的eDNA與基因組

15、DNA進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析eDNA來源。
　　結(jié)果：
　　1.BF中eDNA的檢測
　?。?）SR-11與ST6 BF中均含有eDNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示其相對分子量均大于10.0kb。隨時間延長，細菌BF中eDNA含量均逐漸增加，SR-11形成的BF中eDNA明顯多于ST6（P<0.01）。
　?。?）SR-11和ST6 BF培養(yǎng)48h用DDAO染色后，CLSM觀察發(fā)現(xiàn)SR-11形成的BF中，在表達GF

16、P的活菌和裂解的紅色死菌輪廓中有成片的紅色eDNA；ST6 BF中僅見稀疏散在的紅色eDNA。
　　2.eDNA對細菌BF形成及三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用
　?。?）結(jié)晶紫半定量法結(jié)果顯示，用微量平板在培養(yǎng)受試菌時加入50μg/ml DNase I，SR-11和ST6培養(yǎng)12h后實驗組形成的BF明顯多于對照組（P<0.01）。在受試菌培養(yǎng)時加入5μg/ml的eDNA，SR-11和ST6培養(yǎng)12h后實驗組形成的BF均明顯少于對照組（P

17、<0.01）。受試菌培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，實驗組與對照組未見明顯差異（P>0.05）。
　?。?）CLSM觀察結(jié)果顯示，受試菌培養(yǎng)液中加入50μg/ml DNase I，靜態(tài)培養(yǎng)48h后在小圓玻片底部均能形成大片狀密集的BF，鋪滿整個玻片底部；陰性對照組僅有稀疏散在的菌落。在細菌培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，實驗組與對照組未見明顯差異。
　?。?）受試菌培養(yǎng)液中加入50μg/ml

18、DNase I靜態(tài)培養(yǎng)48 h后，活菌計數(shù)結(jié)果顯示，SR-11和ST6游離狀態(tài)的細菌中兩實驗組和陰性對照組的活菌數(shù)未見明顯差異（P>0.05），BF中固著狀態(tài)的細菌中兩實驗組均明顯多于陰性對照組（P<0.01）；
　　3.RAPD-PCR檢測eDNA的來源
　　RAPD-PCR結(jié)果顯示，SR-11和ST6的eDNA與細菌基因組DNA擴增片段基本相同，說明eDNA來源于細菌裂解后釋放的基因組DNA。
　　結(jié)論：